По поводу иммунитета на SARS-CoV-2.

 На сайте  Медархив  появилась новая статья по поводу изучения Т-клеточного иммунитета на возбудителя КОВИД-19, вируса SARS-CoV-2.

Начнем с краткого ликбеза: клеточный иммунитет включает две основные ветки, первая - это В лимфоциты, которые синтезируют антитела, а вторая это Т лимфоциты, которые убивают инфицированные клетки организма и координируют иммунный ответ. И те, и другие используют похожее орудие - специфический белок-рецептор. В процессе развития лимфоциты-предшественники перетасовывают куски генов рецептора, перетасовки эти случайны, из серии "выберите в слепую по одной карте из трех разных колод, потом случайным образом порежьте края карт и выложите их рядком". Три выложенные карты и являют собой собранный и готовый ген рецептора. У каждого лимфоцита - один рецептор. И если этот рецептор найдет антиген, с который сможет связаться, ключик найдет свой замок, то соответствующий лимфоцит тут же начинает бурно размножаться. Называется это все "клональная экспансия", в США  обожают Звездные Войны - Атака Клонов. Считается, что в одном человеческом организме может быть 10 в 12 степени лимфоцитов несущих примерно 10-100 миллионов разных рецепторов.

 Компания "Приобретенные Биотехнологии" (США) занимается тем, что читает последовательности ДНК и/или РНК рецепторов. Берется, к примеру, пара кубиков (миллилитров) крови, или пара миллионов лимфоцитов, из них выделяют нуклеиновые кислоты, амплифицируют гены рецепторов с помощью ПЦР, а потом все это секвенируют, то есть читают все последовательности рецепторов. Получается немало, около сотни тысяч уникальных рецепторов на пару кубиков крови, причем сырые данные с секвенатора - это обычно от 100 до 2000 миллионов последовательностей на 24-200 образцов в одном прогоне прибора. Именно из-за такого уровня сложности подобные работы стали возможны только в последние 10 лет, когда возникло нужное обеспечение. Ибо самое сложное, это охарактеризовать систему количественно. И главное ноу-хау у "ПБ" - это сложная система синтетических контролей, которые позволяют статистически нормализовать, а потом оценить степень достоверности наблюдений, плюс алгоритмы, проверенные в многолетних тестированиях.

Анализ - прочтение рецепторов от одного пациента на уровне нескольких миллионов клеток стоит около 2000$, это рыночная цена. Все основные американские медстраховки этот анализ покрывают (по назначению врача). Причем читают либо рецепторы В клеток (то есть гены, кодирующие антитела), либо Т клеток. Т клетки можно сортировать на цитотоксичные, которые убивают зараженных, и помощники, координирующие иммунитет. На данном этапе компания "ПБ" зарабатывает деньги на раках крови - разных версиях лейкемий: когда внезапно клон лимфоцитов выходит из под контроля и начинает бурно размножаться. Это сразу видно при прочтении рецепторов - бурная экспансия позволяет легко идентифицировать врага. Лейкемии сейчас неплохо умеют лечить. И  анализ "ПБ" позволяет увидеть успех лечения по снижению плохого клона, а потом мониторить больного, если эспансия пошла снова за счет приобретения устойчивости. Собственно,  клиническая лаборатория "ПБ" была открыта все это время, гоняя анализы, пандемия не отменяет рак, и лейкемию продолжали лечить. У "ПБ" даже выросло количество тестов примерно на 5%. Все ждали обратного, затыка и снижения, врачи ведь заняты вирусом, однако онкологи явно делают свое дело по-прежнему. Анализы принимают только через врача, даже если сам пациент готов заплатить, его никто не будет анализировать, нельзя.

Этот подход позволяет изучать иммунитет на вирусные заболевания, и "ПБ"  тут же кинулись анализировать пациентов с САРС-КоВ2. Пациентов набрали в двух местах - сначала в Италии, а потом в Нью Йорке. Опубликованная статья описывает работу с Т лимфоцитами. Известно, что Т-клеточный ответ является первым по времени компонентом приобретенного иммунного ответа на вирусы, и его удается измерить раньше, чем появляется достаточное количество антител. Кроме того, Т клетки сохраняются в иммунной памяти на долгие годы, что было показано для САРС-1 и МЕРС, и мерить их получается даже тогда, когда антитела уже найти не удается.

Исследование состояло из двух частей. Первая технически была довольно сложна и требовала доступа к пациентам с активной инфекцией: из 61 зараженого пациента отбирали цитотоксичные Т лимфоциты. Нынче есть технология, когда клетки крови сортируют в живом виде, отбирают немного нужных, а все остальное возвращают обратно в вену пациенту. После чего уже в лаборатории, ин витро, эти лимфоциты стимулировали антигенами САРС-КоВ2 (специальным образом "выставленными" на поверхность модельных клеток, имитируя таким образом реальную инфекцию). И смотрели, кто в ответ бурно размножился, путем  обычного секвенирования рецепторов. Цифры впечатляют: таким образом нашли 23 тысячи возможных рецепторов. Кроме того, этот путь использовали для того, чтобы установить, какие части вируса наиболее иммуногенны (что важно для дальнейшей работы).

Вторая часть была технически проще и основана на прямом отборе крови: у 827 зараженных и переболевших пациентов прочли рецепторы Т клеток. После чего сравнили их с базой данных из 3500 контролей, собранных до пандемии, чтобы на этом фоне найти специфические Т-клеточные рецепторы, связанные с новым вирусом. Причем эту работу делали отдельно для двух географий, Италии и Нью Йорка. Как и ожидалось, нашлась масса пересечений, и из них получили диагностический набор возможных специфических Т рецепторов.

Итого, получилось два набора потенциальных анти-Ковидных рецепторов Т клеток - так называемые коммунальные, присутствующие у значительного количества заболевших, и индивидуальные, найденные у небольшого количества. Разница чисто статистическая, и опыт показывает, что с наращиванием числа пациентов все большее количество рецепторов оказываются коммунальными. Что хорошо - когда за те же деньги читаешь все подряд, то больше - это лучше.

Однако даже уже на данном этапе, диагностический набор рецепторов оказался вполне хорош. Была взята независимая группа пациентов, которую не использовали для разработки набора, и у них посмотрели динамику появления и развития диагностических рецепторов. Работы подобного рода делаются вслепую: те, кто выделяют ДНК, гоняют ПЦР, секвенируют и, главное, анализируют данные, не знают, каков статус пациента, было ли заражение, какова стадия и т.п. Образцы анонимизируют еще до присылки в лабораторию, а медицинские данные помещают к так называемому "честному брокеру", который не имеет отношения к лабораторной работе. Честный брокер имеет право открыть медицинские истории только после того, как ему предоставят все экспериментальные данные плюс результаты первичного анализа, и он убедится, что они полны и не требуют дополнительной работы. И только тогда начинается анализ динамики и корреляции данных секвенирования с медицинской историей.

И вот результаты по чувствительности: в первые два дня (0-2), когда даже ПЦР по вирусу еще не сильно справляется, использование диагностических рецепторов дает 77.4%, в 3-7 дней, когда антител еще нет или мало, - 89.6%, а к 8-14 дням - 100%. Через месяц после выздоровления чувствительность 92-94%, и сохраняется на уровне 90% в течение по крайней мере 2-х месяцев (как долго - станет ясно позже, когда время пройдет). Конечно, анализ дорогой и занимает время, требуется примерно неделя (чистого времени в лабе 2 дня). Но он лучше, чем анализ на антитела, так как позволяет ловить асимптоматические случаи, Т-клеточный ответ возникает не только раньше антител, но еще и в случаях, когда антитела совсем не развиваются, при легких случаях. И стабильно остается для последующего анализа, если надо выяснить, а встречался ли больной когда-либо с данным вирусом. Так что если инфекция была, то анализ достаточно сделать один раз, и готово. Учитывая, что диагностический набор рецепторов большой, очень трудно себе вообразить ложно-положительные результаты, откуда им взяться? Ложно-отрицательные возможны на данном этапе, но их вероятность стремительно уменьшается при увеличении набора рецепторов. Работа в этом направлении идет сейчас очень активно. Есть и еще одно применение: похоже, что в случаях тяжелой болезни, Т клеточный иммунитет очень силен, через него, похоже, и развивается цитокиновый шторм. По-видимому, это можно было бы заранее отловить для лечения, но на данном этапе нет достаточного количества данных.

Сразу отвечу на вопрос про вакцины:  подход "ПБ" можно использовать, чтобы смотреть развитие иммунного ответа на вакцину. Но по нынешним правилам ФДА, этих данных по развитию иммунитета недостаточно для получения разрешения: нужны данные по тому, насколько вакцина помогает от реальной вирусной инфекции.