CRISPR для чай­ни­ков, или Крат­кая справ­ка по быст­ро­му ре­дак­ти­ро­ва­нию ДНК

Воз­мож­ность из­ме­нять фраг­мен­ты ДНК все­гда была свя­тым Гра­алем био­тех­но­ло­гии и ме­ди­ци­ны. CRISPR поз­во­ля­ет де­лать это с неви­дан­ной ранее ско­ро­стью и эф­фек­тив­но­стью. Счи­тай­те, что био­ло­ги рань­ше ра­бо­та­ли на пи­шу­щей ма­шин­ке, а бла­го­да­ря CRISPR в од­но­ча­сье пе­ре­се­ли на MacBook. Не зря от­кры­тие этого ме­то­да в 2020 году удо­сто­и­лось Но­бе­лев­ской пре­мии по химии.

Резка мо­ле­ку­лы ДНК с по­мо­щью CRISPR-​Cas9 (рис. Джа­нет Иваса)

Под катом — рас­сказ о по­яв­ле­нии CRISPR, прин­ци­пах ра­бо­ты и при­ме­не­нии в на­сто­я­щем и бу­ду­щем. Да, вы все верно по­ня­ли, это про ре­дак­ти­ро­ва­ние коров, синюю клуб­ни­ку и ар­бу­зы раз­ме­ром со сливу с Aliexpress.

Эта ста­тья — пе­ре­ра­бо­тан­ная вер­сия лек­ции Бо­ри­са Кли­мо­ви­ча, на­уч­но­го со­труд­ни­ка Уни­вер­си­тет­ской кли­ни­ки Тю­бин­ге­на и Немец­ко­го цен­тра ис­сле­до­ва­ний рака (DKFZ), ко­то­рая про­шла в конце но­яб­ря при под­держ­ке Точки ки­пе­ния ЯрГУ.

При­зна­ние к CRISPR при­шло в 2012 году — после пуб­ли­ка­ции но­бе­лев­ской ра­бо­ты. Но, как это обыч­но бы­ва­ет в науке, от­кры­тие — не лич­ная за­слу­га пары ав­то­ров. В этот раз участ­ни­ков со­бы­тий было много, и на­ча­лось все вовсе не с ге­не­ти­ки.

Все на­ча­лось с «гря­зе­ко­па­те­ля»

Аб­бре­ви­а­ту­ра CRISPR по­яви­лась в конце 80-х в ходе ис­сле­до­ва­ний со­лон­ча­ков рядом с ис­пан­ским го­ро­дом Али­кан­те. Ас­пи­рант Фран­сис­ко Мо­хи­ка изу­чал ар­хе­бак­те­рий, жи­ву­щих в со­ле­ной воде, и на­ткнул­ся на стран­ные па­лин­дром­ные по­сле­до­ва­тель­но­сти в их ге­но­ме.

Фраг­мен­ты дли­ной около 30 нук­лео­ти­дов по­вто­ря­лись много раз и от­де­ля­лись друг от друга уни­каль­ны­ми участ­ка­ми ДНК при­мер­но такой же длины.

Упро­щен­но об­на­ру­жен­ная струк­ту­ра вы­гля­де­ла так:

На тот мо­мент никто не по­ни­мал, зачем нужны эти струк­ту­ры. Со­шлись на том, что они необ­хо­ди­мы для некой ре­гу­ля­ции (стан­дарт­ное «объ­яс­не­ние» в био­ло­гии, когда ни­че­го не по­нят­но). Струк­ту­рам сна­ча­ла дали на­зва­ние SRSR (Short Regularly Spaced Repeats), а потом пе­ре­име­но­ва­ли в CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Palindromic Repeats).

Про­дол­жив ра­бо­ту в том же на­прав­ле­нии, Мо­хи­ка нашел по­хо­жие по­вто­ры у мно­гих дру­гих бак­те­рий. И эта за­ко­но­мер­ность при­влек­ла вни­ма­ние.

В 2002 году рядом с CRISPR-​массивами у всех бак­те­рий вы­яви­ли по­хо­жие на них струк­ту­ры — груп­пу белок-​кодирующих генов, ко­то­рую на­зва­ли «очень ори­ги­наль­но» — CAS (CRISPR-​Associated Genes).

Про­дви­нуть­ся даль­ше помог сво­е­го рода «ге­не­ти­че­ский Google»: GenBank, куда уче­ные скла­ди­ру­ют все про­чи­тан­ные по­сле­до­ва­тель­но­сти ДНК. К на­ча­лу 2000-х годов там на­ко­пи­лось уже до­ста­точ­но ин­фор­ма­ции, чтобы при по­мо­щи ал­го­рит­мов BLAST найти, в каких ор­га­низ­мах встре­ча­ют­ся по­хо­жие CRISPR-​последовательности.

GenBank — от­кры­тая ан­но­ти­ро­ван­ная база ге­не­ти­че­ской ин­фор­ма­ции. На июнь 2019 года в ней со­дер­жа­лась ин­фор­ма­ция о 329 млрд пар ос­но­ва­ний и 213 млн по­сле­до­ва­тель­но­стей. Ис­точ­ник — American Health Information Management Association

Поиск вы­явил ин­те­рес­ную вещь: фраг­мен­ты CRISPR встре­ча­ют­ся в ДНК бак­те­рио­фа­гов — ви­ру­сов, ко­то­рые ин­фи­ци­ру­ют бак­те­рии и уби­ва­ют их. По­лу­ча­ет­ся, что бак­те­рии хра­нят внут­ри себя фраг­мен­ты ДНК своих злей­ших вра­гов.

Так воз­ник­ла клю­че­вая до­гад­ка о том, что CRISPR — это им­мун­ная па­мять бак­те­рий, со­хра­ня­ю­щих ин­фор­ма­цию о ви­ру­сах, ко­то­ры­ми бо­ле­ли.

Сфор­му­ли­ро­вав эту тео­рию, Мо­хи­ка сел пи­сать ста­тью, ко­то­рую от­пра­вил в самый пре­стиж­ный био­ло­ги­че­ский жур­нал — Nature. Ста­тью от­кло­ни­ли. Затем он пы­тал­ся ее при­стро­ить в че­ты­ре дру­гих жур­на­ла, но успе­ха до­бил­ся лишь через 18 ме­ся­цев.

Кста­ти, в этом он да­ле­ко не ре­корд­смен. В свое время ра­бо­ту Линн Мар­гу­лис, пред­ло­жив­шую по­пу­ляр­ную нынче ги­по­те­зу сим­био­ге­не­за, от­кло­ня­ли 15 раз! Можно ска­зать, что Мо­хи­ка по­вез­ло. Его ра­бо­ту опуб­ли­ко­ва­ли быст­рее, а идея нашла своих сто­рон­ни­ков.

Ос­нов­ная функ­ция CRISPR

Сле­ду­ю­щий шаг в раз­ви­тии тех­но­ло­гии сде­лал мик­ро­био­лог Фи­липп Хор­ват. В своей док­тор­ской ра­бо­те он ис­сле­до­вал за­квас­ки к эль­зас­ской ква­ше­ной ка­пу­сте, а если точ­нее — мо­лоч­но­кис­лые бак­те­рии, ко­то­рые ее ква­сят.

С по­яв­ле­ни­ем CRISPR за­квас­ка ка­пу­сты стала бес­про­блем­ным делом (нет, саму ка­пу­сту не тро­га­ли)

После док­тор­ской он ушел в мо­лоч­ную про­мыш­лен­ность, где столк­нул­ся с про­бле­мой бак­те­рио­фа­гов. Они силь­но вре­ди­ли за­ква­соч­ным куль­ту­рам, про­из­во­ди­те­ли мо­лоч­ных про­дук­тов несли огром­ные убыт­ки. Хо­варт искал спо­со­бы сде­лать за­квас­ки устой­чи­вы­ми к бак­те­рио­фа­гам и на­ткнул­ся на ра­бо­ты о CRISPR. Ис­сле­дуя эту тему, он до­ка­зал, что устой­чи­вые к ви­ру­сам бак­те­рии пе­ре­ни­ма­ют часть их ДНК.

Бак­те­ри­аль­ная клет­ка, ко­то­рая пе­ре­нес­ла ин­фек­цию бак­те­рио­фа­гом и не умер­ла, на­ре­за­ет его геном на мел­кую «вер­ми­шель», встра­и­ва­ет в CRISPR-​массивы и пе­ре­да­ет эту ин­фор­ма­цию своим по­том­кам, ко­то­рые ста­но­вят­ся устой­чи­вы­ми к бак­те­рио­фа­гу.

Позже ком­па­нию, в ко­то­рой ра­бо­тал Хор­ват, ку­пи­ла кор­по­ра­ция DuPont. А по­сколь­ку она про­из­во­дит при­мер­но 40% за­ква­сок для со­вре­мен­ной мо­лоч­ной про­мыш­лен­но­сти, вы прак­ти­че­ски на­вер­ня­ка стал­ки­ва­лись с CRISPR в со­ста­ве йо­гур­тов, пиццы или сыра.

Ра­бо­ты Хор­ва­та по­ка­за­ли, что CRISPR-​массивы — это дей­стви­тель­но им­мун­ная си­сте­ма бак­те­рий.
Это ра­бо­та­ет так: ку­соч­ки ДНК бак­те­рио­фа­гов со­хра­ня­ют­ся в ДНК бак­те­рий в виде CRISPR-​массивов. Затем они пре­вра­ща­ют­ся в РНК. В этом же куске ге­но­ма у бак­те­рий ко­ди­ру­ет­ся так на­зы­ва­е­мая тракр-​РНК (tracrRNA). Вме­сте они фор­ми­ру­ют guideRNA, или на­во­дя­щую РНК, ко­то­рая затем объ­еди­ня­ет­ся с бел­ком Cas9.
Cas9 — это нук­ле­аза, фер­мент, ко­то­рый умеет ре­зать ДНК. При по­мо­щи guideRNA этот фер­мент на­во­дит­ся на спе­ци­фи­че­ский сег­мент в ДНК бак­те­рио­фа­га, са­дит­ся на него и раз­ре­за­ет, как нож­ни­ца­ми, чем на­ру­ша­ет раз­мно­же­ние ви­ру­са.

Но­бе­лев­ская ста­тья по ре­дак­ти­ро­ва­нию генов

Когда две за­ме­ча­тель­ные женщины-​ученые Эм­ма­ну­эль Шар­пан­тье и Джен­ни­фер Да­уд­на встре­ти­лись на кон­фе­рен­ции в Коста-​Рике, пред­на­зна­че­ние CRISPR уже было из­вест­но. Им при­шла в го­ло­ву сме­лая идея: при­спо­со­бить эту си­сте­му для резки любой ДНК. Они объ­еди­ни­ли силы своих ла­бо­ра­то­рий и в 2012 году в жур­на­ле Science опуб­ли­ко­ва­ли ре­зуль­та­ты ра­бо­ты.

Ил­лю­стра­ция из ори­ги­наль­ной ста­тьи

Им уда­лось объ­еди­нить две РНК в одну single guide RNA и по­ка­зать, что ме­ха­низм резки ра­бо­та­ет.

Тут надо по­яс­нить, что резка — это и есть ос­нов­ной этап ре­дак­ти­ро­ва­ния ДНК. А CRISPR — ге­не­ти­че­ские нож­ни­цы. Все де­та­ли ниже.

За эту ра­бо­ту в 2020 году они по­лу­чи­ли Но­бе­лев­скую пре­мию по химии.

Эм­ма­ну­эль Шар­пан­тье и Джен­ни­фер Да­уд­на

Это со­бы­тие уни­каль­но по двум па­ра­мет­рам.

Во-​первых, это пер­вая пре­мия, ко­то­рую по­лу­чи­ли две жен­щи­ны без со­про­вож­да­ю­щей муж­ской ком­па­нии.
Во-​вторых, эта пре­мия очень «быст­рая». С мо­мен­та пуб­ли­ка­ции до ее при­суж­де­ния про­шло всего во­семь лет.

Вли­я­ние тех­но­ло­гии CRISPR проще всего про­ил­лю­стри­ро­вать, по­ка­зав ча­сто­ту упо­ми­на­ний этой аб­бре­ви­а­ту­ры в на­уч­ной ли­те­ра­ту­ре, ко­то­рая после 2012 года рас­тет как на дрож­жах.

Число упо­ми­на­ний CRISPR в на­уч­ной ли­те­ра­ту­ре

Вто­рой по­ка­за­тель — ко­ли­че­ство па­тен­тов.

Эта ста­ти­сти­ка по­ка­зы­ва­ет, на­сколь­ко все из­ме­ни­лось. Тех­но­ло­гии ре­дак­ти­ро­ва­ния ге­но­ма пред­ла­га­лись и ранее, но ни одна из них не до­стиг­ла та­ко­го успе­ха.

Как про­ис­хо­дит ре­дак­ти­ро­ва­ние ДНК

Пер­вая но­бе­лев­ская ста­тья де­мон­стри­ро­ва­ла ре­дак­ти­ро­ва­ние ДНК в про­бир­ке. Перед уче­ны­ми сто­я­ла ам­би­ци­оз­ная за­да­ча — по­вто­рить про­цесс в клет­ках че­ло­ве­ка. Фэн Чжан из MIT оп­ти­ми­зи­ро­вал про­цесс, сде­лав его сов­ме­сти­мым с жи­вы­ми клет­ка­ми, у ко­то­рых есть ядра.

Фэн Чжан пе­ре­нес тех­но­ло­гию из про­бир­ки в живые клет­ки

В 2013 году после пуб­ли­ка­ции ра­бо­ты Чжана эта тема стала до­ми­ни­ру­ю­щей. По­яви­лись со­об­ще­ния о том, что от­ре­дак­ти­ро­ва­ли геном че­ло­ве­ка, мыши, дрож­жей, ни­ма­тод, дро­зо­фи­лы, ре­зухо­вид­ки Таля, рыбки данио-​рерио — всех име­ю­щих­ся у био­ло­гов мо­дель­ных объ­ек­тов.

Важно по­ни­мать, что ДНК — это очень ста­биль­ная мо­ле­ку­ла. Ее можно ки­пя­тить или остав­лять ле­жать в земле на сотни тысяч лет.

Самая ста­рая се­кве­ни­ро­ван­ная ДНК на се­го­дняш­ний день имеет воз­раст 1,7 млн лет.

Од­на­ко мо­ле­ку­ла ДНК очень чув­стви­тель­на к раз­ры­вам. Если это слу­ча­ет­ся, клет­ка за­пус­ка­ет про­цесс по­чин­ки ДНК. Он может идти двумя пу­тя­ми:

• Не го­мо­ло­гич­ный ва­ри­ант — когда место раз­ры­ва устра­ня­ет­ся с де­фек­та­ми. В ре­зуль­та­те в ДНК может по­явить­ся ма­лень­кая встав­ка или про­изой­ти по­те­ря фраг­мен­та. Ге­не­ти­че­ский код — это ти­пле­ты, то есть три нук­лео­ти­да ко­ди­ру­ют одну ами­но­кис­ло­ту. Если вы вы­ре­за­ли два или вста­ви­ли че­ты­ре нук­лео­ти­да, на­ру­шит­ся по­сле­до­ва­тель­ность, ко­ди­ру­ю­щая белок. Воз­ник­нет сдвиг рамки счи­ты­ва­ния, в ре­зуль­та­те ко­то­ро­го ген фак­ти­че­ски пе­ре­ста­нет вы­пол­нять свою функ­цию, так как клет­ка не смо­жет ис­поль­зо­вать его ин­фор­ма­цию, чтобы син­те­зи­ро­вать функ­ци­о­наль­ный белок.

Сло­мать ген можно было и рань­ше, про­сто это до­воль­но тру­до­ем­ко: надо об­лу­чать гены ра­ди­а­ци­ей, ме­ся­ца­ми ис­кать му­та­ции. Бла­го­да­ря CRISPR про­цесс стал го­раз­до проще.

• Го­мо­ло­гич­ная ре­ком­би­на­ция. У всех жи­вот­ных в клет­ках как ми­ни­мум две копии каж­дой хро­мо­со­мы. Если воз­ни­ка­ет раз­рыв, клет­ка может ис­поль­зо­вать вто­рую хро­мо­со­му и на ее ос­но­ва­нии до­стро­ить по­вре­жден­ный уча­сток — ско­пи­ро­вать его в по­вре­жден­ную хро­мо­со­му. В этой си­ту­а­ции клет­ку можно об­ма­нуть и под­су­нуть ей вме­сто вто­рой хро­мо­со­мы по­хо­жий фраг­мент ДНК, но с му­та­ци­ей. Тогда клет­ка по­чи­нит раз­рыв, встро­ив в него то, что мы под­су­ну­ли, — так на­зы­ва­е­мую мат­ри­цу.

За счет при­цель­но вно­си­мо­го раз­ры­ва, ко­то­рый де­ла­ет CRISPR, по­яви­лась воз­мож­ность очень про­сто и эф­фек­тив­но за­ме­нять фраг­мен­ты в ге­но­ме — вно­сить стро­го опре­де­лен­ные му­та­ции и чи­нить сло­ман­ные гены. Но есть про­бле­ма: ре­па­ра­ция чаще всего про­хо­дит по не го­мо­ло­гич­но­му пути. Су­ще­ству­ют раз­ные ме­то­ды, поз­во­ля­ю­щие сдви­нуть про­цесс в сто­ро­ну го­мо­ло­гич­ной ре­пли­ка­ции, но пока они ра­бо­та­ют не очень хо­ро­шо.

Левая ветвь — не го­мо­ло­гич­ный ва­ри­ант за­ме­ны, при­во­дя­щий к раз­ру­ше­нию гена, пра­вая — успеш­ная по­чин­ка под­хо­дя­щим фраг­мен­том

Тех­но­ло­гии ре­дак­ти­ро­ва­ния ге­но­ма су­ще­ство­ва­ли и ранее. Но они тре­бо­ва­ли сбор­ки так на­зы­ва­е­мых ка­стом­ных бел­ков — под заказ. Для каж­дой опе­ра­ции нужно было со­би­рать новый белок. Это за­ни­ма­ло несколь­ко недель и даже ме­ся­цев. Стоил каж­дый такой белок несколь­ко тысяч евро. А CRISPR-​реагенты стоят 10‒20 евро — в сотни раз мень­ше. Стало воз­мож­ным про­во­дить экс­пе­ри­мен­ты го­раз­до быст­рее и в огром­ных мас­шта­бах. Если вам в вос­кре­се­нье при­шла хо­ро­шая идея, то через неде­лю у вас уже будет кле­точ­ная линия с го­то­вой му­та­ци­ей, — и идею можно будет про­ве­рить.

Есте­ствен­но, это под­толк­ну­ло раз­ви­тие био­тех­но­ло­гий и про­мыш­лен­но­сти. По­яви­лись ты­ся­чи ком­па­ний, ко­то­рые пы­та­ют­ся ком­мер­ци­а­ли­зи­ро­вать CRISPR. Па­рал­лель­но идет па­тент­ная война между MIT и Уни­вер­си­те­том Берк­ли, где ра­бо­та­ет Джен­ни­фер Да­уд­на.

При­ме­не­ние CRISPR-​Cas9

Что можно сде­лать с по­мо­щью CRISPR? Можно сло­мать, по­чи­нить, за­ме­нить прак­ти­че­ски любой ген в ге­но­ме. Факт: био­ло­ги любят ло­мать гены, чтобы вы­яс­нить, как они ра­бо­та­ют.

Можно сде­лать хро­мо­сом­ную пе­ре­строй­ку. Это очень важно в он­ко­ло­гии, где ряд за­бо­ле­ва­ний вы­зы­ва­ют хро­мо­сом­ные пе­ре­строй­ки.

На сле­ду­ю­щем этапе тех­но­ло­гию улуч­ши­ли, лишив Cas-​нуклеазу ак­тив­но­сти — сде­ла­ли ее не ре­жу­щей. Од­но­вре­мен­но «при­стег­ну­ли» к ней дру­гие фер­мен­ты. В итоге она про­сто са­дит­ся на стро­го опре­де­лен­ный фраг­мент ДНК и может его ре­дак­ти­ро­вать, не вы­зы­вая по­вре­жде­ний. На­при­мер, ме­нять азо­ти­стые ос­но­ва­ния без вне­се­ния раз­ры­вов в ДНК, что очень важно для био­ме­ди­цин­ских задач.

Уче­ные уже на­учи­лись ак­ти­ви­ро­вать или ре­прес­си­ро­вать ра­бо­ту гена — ре­дак­ти­ро­вать эпи­ге­ном. Из­вест­но, что неко­то­рые гены в ор­га­низ­ме ме­ти­ли­ро­ван­ные, кроме того, су­ще­ству­ют спе­ци­аль­ные белки — ги­сто­ны, ко­то­рые свя­за­ны с ДНК. Все это опре­де­ля­ет, как ведет себя клет­ка. CRISPR поз­во­ля­ет вли­ять и на это.

При по­мо­щи CRISPR можно про­из­во­дить вы­со­ко­точ­ную мик­ро­ско­пию участ­ков ге­но­ма. Это со­зда­ет огром­ные воз­мож­но­сти для изу­че­ния и на­сто­я­щий взрыв тех­но­ло­гий, ко­то­рый до 2012 года невоз­мож­но было себе пред­ста­вить.

Ре­дак­ти­ру­ем коров, собак и по­ми­до­ры

Для чего еще ис­поль­зу­ет­ся по­доб­ное ре­дак­ти­ро­ва­ние? На­при­мер, пятна у по­ро­ды коров сде­ла­ли из черно-​белых серо-​белыми. Счи­та­ет­ся, что так они лучше пе­ре­но­сят жару.

Со­ба­кам по­ро­ды бигль до­ба­ви­ли мышц. Прак­ти­че­ский смысл этой, несо­мнен­но, боль­шой ра­бо­ты мне неясен. Но ра­бо­ту вы­пол­ня­ли ки­тай­цы. Воз­мож­но, у них свое пред­став­ле­ние о пре­крас­ном.

Че­ло­ве­че­ских ор­га­нов для пе­ре­сад­ки все­гда не хва­та­ет, по­это­му пе­ре­са­жи­ва­ют ор­га­ны сви­ней. Но тут есть про­бле­ма: у них в ге­но­ме при­сут­ству­ет много спя­щих ре­тро­ви­ру­сов, ко­то­рые после пе­ре­сад­ки могут ак­ти­ви­ро­вать­ся и угро­жать здо­ро­вью па­ци­ен­та. У сви­нок на фото эти фраг­мен­ты в ге­но­ме инак­ти­ви­ро­ва­ли.

Еще при­мер: с по­мо­щью CRISPR от­ре­дак­ти­ро­ва­ли ко­ли­че­ство ветв­ле­ний на то­мат­ной ветке. А также раз­ме­ры пло­дов. Все это на фото выше.

От­ре­дак­ти­ро­ван­ных рас­те­ний уже очень много. О мас­шта­бах можно су­дить по ко­ли­че­ству пуб­ли­ка­ций в на­уч­ных жур­на­лах.

Те­перь вы зна­е­те, от­ку­да на Aliexpress се­ме­на синей клуб­ни­ки, чер­ных по­ми­до­ров и ар­бу­зов раз­ме­ром со сливу

Но в ма­га­зи­нах (по край­ней мере в Ев­ро­пе) CRISPR-​модифицированных про­дук­тов нет. Это свя­за­но ис­клю­чи­тель­но с осто­рож­но­стью ре­гу­ля­то­ра, на мой взгляд, из­лиш­ней.

Рань­ше ге­не­ти­че­ски мо­ди­фи­ци­ро­ван­ные про­дук­ты в Ев­ро­пе за­пре­ща­ли, по­то­му что не знали, что про­изой­дет, если эти мо­ди­фи­ци­ро­ван­ные рас­те­ния по­па­дут в дикую при­ро­ду. Может быть, если генно-​модифицированная ку­ку­ру­за «во­рвет­ся» в леса, там вы­мрут все бе­ре­зы. Также не знали, как они по­вли­я­ют на здо­ро­вье че­ло­ве­ка в дол­го­сроч­ной пер­спек­ти­ве, по­то­му что при мо­ди­фи­ка­ции ис­поль­зо­ва­ли ге­не­ти­че­ские эле­мен­ты из дру­гих ор­га­низ­мов.

CRISPR поз­во­ля­ет вно­сить му­та­ции, не остав­ляя сле­дов, по­сколь­ку внед­ря­е­мые РНК и белок в клет­ке де­гра­ди­ру­ют. От них ни­че­го не оста­ет­ся, со­хра­ня­ет­ся толь­ко сама му­та­ция. Фак­ти­че­ски CRISPR де­ла­ет то же самое, что про­ис­хо­дит при се­лек­ции. Несмот­ря на это, су­перо­сто­рож­ные ре­гу­ля­то­ры ре­ши­ли, что раз­ре­шать CRISPR пока не стоит.

Я, как уче­ный, счи­таю, что нужно раз­ре­шать, и тогда нас ждет на­сто­я­щий взрыв тех­но­ло­ги­че­ско­го раз­ви­тия. С по­мо­щью CRISPR мы смо­жем ре­шить очень мно­гие про­бле­мы, в том числе свя­зан­ные с гло­баль­ным по­теп­ле­ни­ем.

На­при­мер, вы­ве­сти за­су­хо­устой­чи­вые или более про­дук­тив­ные сорта рас­те­ний, ко­то­рые поз­во­лят ис­поль­зо­вать мень­ше па­хот­ных зе­мель, не при­ме­нять пе­сти­ци­ды или удоб­ре­ния.

CRISPR в био­ме­ди­цине

Самый вол­ну­ю­щий во­прос — при­ме­не­ние CRISPR в био­ме­ди­цин­ских ис­сле­до­ва­ни­ях для улуч­ше­ния жизни боль­ных людей (а может, и здо­ро­вых — в пер­спек­ти­ве). Глав­ная слож­ность тут — в до­став­ке «ге­не­ти­че­ских нож­ниц» в клет­ки че­ло­ве­ка. До­пу­стим, нам нужно по­чи­нить нера­бо­та­ю­щий ген, ко­то­рый вы­зы­ва­ет бо­лезнь. Но чи­нить его надо в целом ор­гане или даже во всем теле.

К при­ме­ру, му­та­цию, вы­зы­ва­ю­щую диа­бет, надо чи­нить во всей под­же­лу­доч­ной же­ле­зе. Это непро­сто, по­то­му что клет­ки пре­крас­но себя за­щи­ща­ют от втор­же­ния чу­же­род­ной ДНК. По­это­му ис­сле­до­ва­те­ли на­ча­ли с тех вещей, ко­то­рые можно из че­ло­ве­ка вы­нуть, от­ре­дак­ти­ро­вать в про­бир­ке, затем раз­мно­жить и вер­нуть об­рат­но, — с кост­но­го мозга и крови.

Здесь по­ка­за­но, как с по­мо­щью CRISPR лечат бета-​талассемию и сер­по­вид­но­кле­точ­ную ане­мию.

Эти бо­лез­ни вы­зва­ны двумя раз­ны­ми му­та­ци­я­ми в гене бета-​гемоглобина.

Боль­ным бета-​талассемией нужны ча­стые пе­ре­ли­ва­ния крови. У боль­ных сер­по­вид­но­кле­точ­ной ане­ми­ей эрит­ро­ци­ты за­би­ва­ют со­су­ды. Ка­че­ство жизни у них низ­кое, и есть риск ран­ней смер­ти.

Что в такой си­ту­а­ции поз­во­ля­ет сде­лать CRISPR? У че­ло­ве­ка есть тре­тий ген ге­мо­гло­би­на — фе­таль­ный ге­мо­гло­бин, ко­то­рый ак­ти­вен толь­ко у эм­бри­о­нов до рож­де­ния. После рож­де­ния он вы­клю­ча­ет­ся, ра­бо­та­ют взрос­лые альфа-​ и бета-​гемоглобины. CRISPR поз­во­ля­ет вклю­чить ген фе­таль­но­го ге­мо­гло­би­на — вы­клю­чив ген, ко­то­рый его кон­тро­ли­ру­ет.

У двух боль­ных жен­щин за­бра­ли клет­ки кост­но­го мозга и при по­мо­щи ви­ру­са внед­ри­ли в них CRISPR-​конструкцию, ко­то­рая инак­ти­ви­ро­ва­ла ген BCL11A. В этих клет­ках за­ра­бо­тал фе­таль­ный ге­мо­гло­бин. Пра­виль­но от­ре­дак­ти­ро­ван­ные, от­се­лек­ти­ро­ван­ные и раз­мно­жен­ные клет­ки вер­ну­ли па­ци­ен­там об­рат­но — пе­ре­са­ди­ли им их же кост­ный мозг. После этого па­ци­ент­ке с бета-​талассемией, ко­то­рой нужно было в сред­нем 16 пе­ре­ли­ва­ний крови в год, в те­че­ние года не по­на­до­би­лось ни одной про­це­ду­ры. То же про­изо­шло и с боль­ной сер­по­вид­но­кле­точ­ной ане­ми­ей — их ре­аль­но вы­ле­чи­ли.

Эти ра­бо­ты пе­ре­шли на сле­ду­ю­щую ста­дию кли­ни­че­ских ис­пы­та­ний — в бли­жай­шее время этот метод может войти в по­все­мест­ную прак­ти­ку.

Сле­ду­ю­щее на­прав­ле­ние ра­бо­ты — те­ра­пия ВИЧ. Есть люди, ко­то­рые не за­ра­жа­ют­ся ви­ру­сом им­му­но­де­фи­ци­та че­ло­ве­ка за счет му­та­ции в гене CCR5 — де­ле­ции в 32 нук­лео­ти­да. Если у че­ло­ве­ка обе копии гена му­ти­ро­ва­ны, вирус про­сто не может про­ник­нуть в их клет­ки.

У части па­ци­ен­тов на фоне ВИЧ раз­ви­ва­ет­ся лим­фоб­ласт­ный лей­коз (рак крови). Если дру­гие ме­то­ды те­ра­пии не по­мо­га­ют, боль­ным лим­фоб­ласт­ным лей­ко­зом часто пе­ре­са­жи­ва­ют кост­ный мозг. В этом слу­чае взяли кост­ный мозг у до­но­ра, ко­то­рый под­хо­дил для ле­че­ния лей­ке­мии.

Перед пе­ре­сад­кой клет­ки от­ре­дак­ти­ро­ва­ли с по­мо­щью CRISPR, вы­клю­чив в них ген CCR5, — по­вто­ри­ли му­та­цию, ко­то­рая су­ще­ству­ет в при­ро­де. Пе­ре­сад­ка вы­ле­чи­ла па­ци­ен­та и от лей­ко­за, и от ВИЧ.

На мой взгляд, это одна из самых ярких де­мон­стра­ций воз­мож­но­стей CRISPR.

CRISPR и этика

Го­во­ря о ВИЧ, нель­зя не вспом­нить о самом на­шу­мев­шем слу­чае ис­поль­зо­ва­ния CRISPR. Это ис­то­рия 2018 года. Ви­нов­ник со­бы­тий — Цзянь­куй Хэ, ки­тай­ский уче­ный, ко­то­рый про­вел экс­пе­ри­мент с ре­дак­ти­ро­ва­ни­ем че­ло­ве­че­ских эм­бри­о­нов.

За ре­дак­ти­ро­ва­ние ДНК че­ло­ве­ка Цзянь­куй Хэ по­лу­чил три года тюрь­мы

Он за­ни­ма­ет­ся ЭКО. По­лу­чив эм­бри­о­ны от пар, где отцы были ин­фи­ци­ро­ва­ны ВИЧ, он по­пы­тал­ся с по­мо­щью CRISPR вы­клю­чить в них ген CCR5. В ре­зуль­та­те экс­пе­ри­мен­та ро­ди­лось трое внешне здо­ро­вых детей.

Од­на­ко про­изо­шло лишь ча­стич­ное ре­дак­ти­ро­ва­ние. У одной де­воч­ки пер­вая копия гена по­лу­чи­лась с 15-​нуклеотидной де­ле­ци­ей, чего ока­за­лось недо­ста­точ­но, чтобы ген пе­ре­стал функ­ци­о­ни­ро­вать. А вто­рая копия гена — без из­ме­не­ний. В итоге ни­ка­кой за­щи­ты де­воч­ка не по­лу­чи­ла. Со вто­рой де­воч­кой по­лу­чи­лось лучше, но ген все равно остал­ся ча­стич­но функ­ци­о­наль­ным.

Про­бле­ма этого экс­пе­ри­мен­та — в на­ру­ше­нии эти­че­ских норм и за­ко­нов. Как вы­яс­ни­лось, Цзянь­куй Хэ фаль­си­фи­ци­ро­вал раз­ре­ше­ние эти­че­ской ко­мис­сии, ко­то­рая не одоб­ри­ла это ис­сле­до­ва­ние. Во всех стра­нах у нор­маль­ных уче­ных это озна­ча­ет пол­ный за­прет, но он его про­игно­ри­ро­вал. Кроме того, экс­пе­ри­мент был плохо под­го­тов­лен, ис­сле­до­ва­тель не взве­сил воз­мож­ные риски. Ре­дак­ти­ро­ва­ние тол­ком не по­лу­чи­лось, а по­след­ствия этих экс­пе­ри­мен­тов могут про­явить себя позже. CRISPR не об­ла­да­ет сто­про­цент­ной точ­но­стью, он может вно­сить му­та­ции где-​то еще в ге­но­ме. И где он их вне­сет, пред­ска­зать слож­но.

Если бы все дети с ВИЧ уми­ра­ли, это ме­ня­ло бы дело. Но с со­вре­мен­ны­ми пре­па­ра­та­ми ВИЧ-​инфицированные ма­те­ри ро­жа­ют ВИЧ-​негативных детей более чем в 90% слу­ча­ев. По­это­му экс­пе­ри­мент был еще и бес­смыс­лен­ный.

Ни один уче­ный в мире не со­мне­вал­ся, что тех­ни­че­ски метод CRISPR поз­во­ля­ет ре­дак­ти­ро­вать эм­бри­о­ны, то есть на­уч­ной но­виз­ны в этом экс­пе­ри­мен­те тоже не было. Но это надо было де­лать с со­блю­де­ни­ем всех норм и дру­гим уров­нем под­го­тов­ки. А глав­ное, тех­но­ло­гия еще недо­ста­точ­но со­зре­ла, чтобы со сто­про­цент­ной га­ран­ти­ей от­ре­дак­ти­ро­вать толь­ко нуж­ное место в ге­но­ме и ни­че­го не сло­мать в осталь­ных.

Граж­да­нин Хэ по­до­рвал веру в уче­ных, по­лу­чив вал кри­ти­ки, почти пол­мил­ли­о­на дол­ла­ров штра­фа и три года ли­ше­ния сво­бо­ды.

Я думаю, до ши­ро­кой прак­ти­ки ре­дак­ти­ро­ва­ния че­ло­ве­че­ских эм­бри­о­нов нам да­ле­ко. Но, без­услов­но, когда-​то мы к этому при­дем, и при по­мо­щи CRISPR будут ле­чить тя­же­лые на­след­ствен­ные за­бо­ле­ва­ния.

Кому сей­час до­сту­пен CRISPR

По­ра­бо­тать с CRISPR могут «не толь­ко лишь все»©. В ин­тер­не­те за неболь­шие день­ги можно ку­пить набор, где есть все необ­хо­ди­мое.

Неко­то­рые экс­пе­ри­мен­ти­ру­ют прямо на соб­ствен­ной кухне

Если у вас есть мало-​мальски обо­ру­до­ван­ная ла­бо­ра­то­рия для про­стей­ших молекулярно-​биологических экс­пе­ри­мен­тов, на­чать ра­бо­тать с CRISPR будет легко. И это дей­стви­тель­но фан­та­сти­че­ский ин­стру­мент, ко­то­рый неве­ро­ят­но уско­рил про­гресс био­ме­ди­цин­ской науки.

Вся эта ис­то­рия учит нас тому, что даже ко­вы­ря­ясь — бук­валь­но — в грязи, можно сде­лать неве­ро­ят­ные от­кры­тия. Ну и еще тому, что наука ин­тер­на­ци­о­наль­на.

Нет ни­ка­кой рос­сий­ской науки, немец­кой науки, есть ин­тер­на­ци­о­наль­ная наука.

Та же Эм­ма­ну­эль Шар­пан­тье ра­бо­та­ла сна­ча­ла в Нью-​Йорке, потом в Мем­фи­се, в Вене, в Шве­ции, в Ган­но­ве­ре, а прямо сей­час ра­бо­та­ет в Бер­лине. По­это­му за­да­ча уче­но­го — знать хотя бы один меж­ду­на­род­ный язык и пы­тать­ся раз­ви­вать соб­ствен­ную мо­биль­ность — дви­гать­ся, ис­кать связи и со­труд­ни­ков, новых кол­лег. Шар­пан­тье и Да­уд­на встре­ти­лись на кон­фе­рен­ции, за­ин­те­ре­со­ва­лись общей про­бле­мой и в итоге по­лу­чи­ли Но­бе­лев­скую пре­мию. Кто знает, как бы сло­жи­лась ис­то­рия CRISPR, не будь этой встре­чи.