Клетки, с которых начинается развитие человека

Две клетки, с которых начинается развитие человека, — бластомеры, являющиеся первыми потомками оплодотворенной яйцеклетки, — выглядят в микроскоп абсолютно одинаково, но судьба их может сложиться совершенно по-разному. Время от времени ученые сталкиваются с людьми, которые «построены» в основном из потомков одного из бластомеров. Причем соотношение вкладов двух первых бластомеров тоже может быть разным — от 2:1 до 9:1. Почему один из них может оказаться «плодовитее» другого, до конца неясно. Объяснений здесь может быть несколько, но результат один: люди — по крайней мере, некоторые — появляются на свет мозаичными. А если так, можно ли по одной части их тела судить о генетических признаках другой? В последнее время вышло сразу несколько интересных работ, в которых ученые пытались с разных сторон подступиться к исследованию такого «неравноправия» бластомеров.

 

12.05.2021 

Рис. 1. Восстановленная родословная клеток в теле 66-летней женщины. Красным обозначено соотношение потомков первых двух бластомеров в крови, голубым — в слюне, желтым — в моче. Изображение из обсуждаемой статьи L. Fasching et al., 2021. Early developmental asymmetries in cell lineage trees in living individuals

Братские разборки

Первый шаг на пути превращения оплодотворенной яйцеклетки в человека — деление на две клетки-бластомера. И уже на этом этапе развития возникает немало вопросов. Например, до конца так и неясно, в какой плоскости это деление происходит, то есть по какой оси дробится зигота, — и зависит ли это от внутренних факторов (распределения органелл или внутриклеточных структур) или происходит случайно, под влиянием сигналов извне.

Это немаловажный вопрос. От того, по какому принципу зародыш делится на клетки, зависит, будут ли они равноценны в дальнейшем. Если, например, в материнской цитоплазме есть градиент каких-нибудь веществ — вроде желтка, который тяготеет к одному из полюсов в яйцеклетках амфибий (рис. 2), — то даже по первым делениям можно предсказать судьбу получающихся бластомеров. Те, кто ближе к желточному (вегетативному) полюсу, окажутся в составе костей, мышц и других тканей мезодермы, а те, кому желтка досталось меньше (анимальный полюс), превратятся в покровы и нервную ткань.

Рис. 2. Раннее развитие лягушки. Та часть яйцеклетки, где меньше желтка, дробится первой, бластомеры в ней крупнее и впоследствии оказываются на «крыше» бластулы. Рисунок с сайта bastiani.biology.utah.edu

В пределе такая неравнозначность бластомеров выливается в детерминированное развитие — как, например, у круглых червей (рис. 3). Внутри их яйцеклетки сигнальные вещества распределены настолько неравномерно, что уже первые два бластомера однозначно различаются: и по форме, и по своей судьбе. Один из них, АВ, получается более крупным, и из него впоследствии вырастает передняя часть тела, с глоткой и нервной системой. Из второго бластомера поменьше, Р, образуется задняя часть тела — и если его удалить, то потомки АВ никак не смогут компенсировать его потерю.

Рис. 3. Дробление аскариды (сверху) и судьба отдельных бластомеров (снизу). Рисунок из книги S. F. Gilbert, 2000. Developmental Biology

Но у большинства животных разделение обязанностей между первыми клетками не столь строгое. Если разбить ранний зародыш морского ежа на отдельные бластомеры, то из каждого вырастет полноценный морской еж. Даже у амфибий можно пересадить клетку анимального полюса на вегетативный — и она ассимилируется, последует примеру соседей и превратится в то же, во что и они. Такое развитие называется регуляционным: судьба клеток регулируется внешними обстоятельствами — давлением, натяжением, концентрацией сигнальных веществ, которые выделяют соседи. В такой конструкции ни у одной клетки нет «предназначения» — ее будущее зависит от того, в какой части структуры она оказалась.

Считается, что развитие млекопитающих тоже регуляционное — и тому есть множество доказательств (рис. 4). Бластомеры, которые образуются при первых делениях дробления, легко можно вынуть из зародыша, не повредив его. На этом основана преимплантационная генетическая диагностика: после искусственного оплодотворения из эмбриона на стадии 8–16 клеток забирают один из бластомеров на генетический анализ. Оставшиеся клетки, не заметив потери собрата, продолжают развиваться и часто вырастают в полноценный плод.

Рис. 4. Раннее развитие человека. Первые дни — дробление, третий день — морула, четвертый день — компактизация, пятый-шестой день — превращение в бластоцисту, далее имплантация. Желтым обозначены клетки, которые дадут ткани зародыша, фиолетовым и голубым — предшественники внезародышевых тканей, серым — неопределившиеся клетки. Изображение из статьи B. Sozen et al., 2021. Reconstructing human early embryogenesis in vitro with pluripotent stem cells

После дробления бластомеры млекопитающих сжимаются в плотную кучку (это называют компактизацией), а затем расходятся, образуя полость внутри. В этот момент они становятся неравноценными — внешний слой дальше может дать только внезародышевые ткани, а внутренний — в основном зародышевые. Но и на этой стадии между собой клетки в каждой группе взаимозаменяемы. По крайней мере, в любой момент внутренняя масса клеток может распасться на две кучки — и каждая вырастет в самостоятельного близнеца.

Тем не менее, когда мы смотрим на взрослого человека и пытаемся отследить происхождение его отдельных клеток, то часто оказывается, что неравноценность возникает гораздо раньше. За последние годы вышло сразу несколько работ, авторы которых делали примерно одно и то же: собирали дифференцированные клетки из разных тканей человека и по набору однонуклеотидных замен в ДНК пытались восстановить их дерево делений. В итоге они получали самые разные пропорции, в которых первые клетки делят между собой обязанности.

Например, группа исследователей из Кембриджа проанализировала 234 клетки крови в организме развивающегося плода. Из них только четыре оказались потомками одного бластомера, все остальные 230 были потомками второго (M. Chapman et al., 2020. Lineage tracing of human development through somatic mutations). В другой статье та же группа пишет о том, что у одного испытуемого ближайшим общим предком клеток крови и эпителия рта была зигота. Это означает, что после первого же деления получились два бластомера с очень разными судьбами: один дал начало покровным тканям (эктодерме), а другой — соединительным (мезодерме) (H. Lee-Six et al., 2018. Population dynamics of normal human blood inferred from somatic mutations). До этого британцы подсчитали, что первые два бластомера в среднем участвуют в образовании тела человека в соотношении 2:1 (Y. S. Ju et al., 2017. Somatic mutations reveal asymmetric cellular dynamics in the early human embryo). А совсем недавно исследовательская группа из США обнаружила, что этот вклад может быть разным у разных людей и в разных органах — от 70:30 до 90:10. Работа с этим результатом была опубликована в одном из недавних номеров журнала Science.

Получается, что время от времени весь (или почти весь) организм человека развивается из одной-единственной клетки — и это не зигота, а один из бластомеров. По крайней мере, довольно часто (а может быть, всегда?) первые два бластомера оказываются неравноценными: один дает начало большей части тела, чем другой, и соотношение между этими частями далеко от 50:50. Объяснить эту несправедливость можно сразу несколькими способами.

Судьба или договоренность

Во-первых, можно предположить, что судьба первых двух клеток изначально предопределена — подобно тому, как это бывает у нематоды. Такая гипотеза существовала в начале 2000-х годов: некоторые ученые полагали, что бластомер, который наследует вегетативную часть яйцеклетки (дальнюю от материнского ядра), впоследствии будет делиться немного медленнее своего собрата и даст внезародышевые ткани (рис. 5, см. K. Piotrowska et al., 2001. Blastomeres arising from the first cleavage division have distinguishable fates in normal mouse development).

Рис. 5. Как может складываться судьба первых бластомеров. Слева — совершенно случайное распределение, справа — полностью детерминированное деление. Но возможны и промежуточные варианты. Изображение из статьи M. Zernicka-Goetz, 2006. The first cell-fate decisions in the mouse embryo: destiny is a matter of both chance and choice

Один из бластомеров действительно часто делится позже другого, и поэтому в зародышах млекопитающих встречается стадия трех клеток (хотя у большинства животных на начальных этапах развития число клеток в норме четное). Но для того, чтобы эта схема воспроизводилась, яйцеклетка млекопитающих всегда должна делиться по одной и той же плоскости, а эта ось должна быть экваториальной, то есть примерно перпендикулярной анимально-вегетативной оси. Но гораздо чаще эмбрион делится в другой плоскости, меридиональной. Правда, до сих пор непонятно, насколько этот процесс случаен (M. Zernicka-Goetz, 2006. The first cell-fate decisions in the mouse embryo: destiny is a matter of both chance and choice). А если веретено первого деления располагается в зиготе случайным образом, то о детерминированном развитии говорить не приходится.

Во-вторых, можно предположить, что бластомеры изначально равноценны, но рано специализируются. Это сложно проверить на людях (для полноценного эксперимента пришлось бы много раз создавать и разрушать эмбрионы), но по крайней мере в зародышах мыши свидетельства этому нашлись. Уже в первых четырех бластомерах удалось обнаружить различия в экспрессии генов. Те, например, в которых транскрипционный фактор Oct3/4 был связан со своими мишенями, чаще делились в вертикальной плоскости и превращались в поверхностные клетки эмбриона, — а затем во внезародышевые ткани (K. Takaoka, H. Hamada, 2012. Cell fate decisions and axis determination in the early mouse embryo). Те же, в которых был более активен ген Sox21, становились внутренней клеточной массой и давали собственные ткани плода (M. Goolam et al., 2016. Heterogeneity in Oct4 and Sox2 Targets Biases Cell Fate in 4-Cell Mouse Embryos).

Кроме того, известно, что в некоторых случаях на стадии бластоцисты клетки могут переходить из зародышевых во внезародышевые и обратно. И это могло бы объяснить неравномерность вклада: если один бластомер дает почти только внезародышевые ткани, логично, что доля его потомков среди клеток взрослого организма оказывается незначительной.

В-третьих, можно представить себе и другую картину: бластомеры изначально равноценны по своим возможностям, но конкурируют между собой, и по мере дробления потомки одного из них оказываются успешнее.

Клеточная конкуренция встречается у самых разных организмов (подробнее см. в новости Спастись от клеток-читеров помогает только изоляция, «Элементы», 06.03.2021). Впервые ее описали в зародышах дрозофилы, но потом нашли и у млекопитающих — как во взрослых тканях, так и в эмбрионах. Механизмы этой внутритканевой борьбы могут быть самыми разными: от механического выдавливания из клеточного слоя до запуска программы апоптоза в проигравших клетках. По некоторым подсчетам, у мышей еще на стадии бластоцисты в неравной битве гибнет около трети клеток эмбриона — те, кто оказались менее «крепкими» и у кого выше количество активированных молекул белка р53, главного двигателя апоптоза (S. Bowling et al., 2018. P53 and mTOR signalling determine fitness selection through cell competition during early mouse embryonic development). А уже после того, как клетки начинают специализироваться, те, кто успел выбрать свою судьбу, «добивают» тех, кто со своей вовремя не определился (M. Hashimoto, H. Sasaki, 2019. Epiblast Formation by TEAD-YAP-Dependent Expression of Pluripotency Factors and Competitive Elimination of Unspecified Cells).

О зародышах человека мы знаем меньше — их сложно изучать напрямую. Поэтому выводы можно делать только по культуре плюрипотентных клеток, аналогу внутренней клеточной массы эмбриона (рис. 6). Известно, что в такой культуре клетки-мутанты (особенно с потенциально онкогенными изменениями) могут одерживать верх и выживать соседей дикого типа. Но происходит ли так с обычными клетками, без онкогенных мутаций, пока неясно (J. Wu, I. Barbaric, 2021. Fitness selection in human pluripotent stem cells and interspecies chimeras: Implications for human development and regenerative medicine).

Рис. 6. Конкуренция в культуре плюрипотентных клеток. Носители онкогенных мутаций появляются как единичные клетки (а), затем обыгрывают своих соседей (b) и вытесняют их из популяции (с). Изображение из статьи J. Wu, I. Barbaric, 2021. Fitness selection in human pluripotent stem cells and interspecies chimeras: Implications for human development and regenerative medicine

Примерно то же самое происходит, судя по всему, и в химерных зародышах. По крайней мере, до недавнего времени все попытки создать эмбрион-химеру из человека и других млекопитающих (мыши, кролика или свиньи) приводили к тому, что клетки-хозяева вызывали в человеческих клетках апоптоз, и их доля в химере оказывалась крайне мала. Единственный способ заставить человеческие клетки выжить в таких условиях — заблокировать в них программу самоубийства. И действительно, клетки-мутанты по разным белкам этого сигнального пути приживаются лучше.

Кстати, именно по этому пути пошли создатели гибрида человека и свиньи: чтобы вырастить человеческую мышцу, они взяли эмбриональные клетки человека, лишенные белка р53. Но такие органы едва ли кто-нибудь решится пересаживать людям — вводить в человеческий организм ткань с мутацией в гене р53 означает обречь пациента на борьбу с опухолями.

Ужиться с обезьяньими клетками может оказаться проще. Недаром доля человеческих клеток в первой химере с обезьяной была выше, чем во всех предыдущих экспериментах: несколько процентов по сравнению с долями процента. Возможно, здесь сыграло какую-то роль близкое родство, но механизмы этого еще предстоит выяснять.

В-четвертых, наконец, есть и еще один вариант развития событий. Возможно, конкуренция приводит не к апоптозу клеток, а к их отступлению во внезародышевые ткани — туда, откуда они не смогут вырасти в опухоль или навредить развитию собственных тканей зародыша.

Хороший пример такого рода конкуренции — избавление зародыша от анеуплоидии. В бластомерах часто встречаются неправильные наборы хромосом, это самая распространенная поломка на ранних стадиях развития. Она может быть, например, следствием нерасхождения материнских хромосом при делении или ошибки удвоения (R. C. McCoy, 2017. Mosaicism in Preimplantation Human Embryos: When Chromosomal Abnormalities Are the Norm). Но каждая такая ошибка грозит зародышу гибелью, поскольку большинство хромосомных аномалий делают организм нежизнеспособным.

В экспериментальных зародышах мыши, которые создавались как химера из обычных и тетраплоидных бластомеров, последние гибнут апоптозом. Но в развитии человека, судя по всему, картина может быть и другой. По крайней мере, в недавней работе очередной группы ученых из Кембриджа выяснилось, что в клетках плаценты подозрительно часто встречаются отклонения от нормального числа хромосом и изменения, похожие на опухолевые (T. Coorens et al., 2021. Inherent mosaicism and extensive mutation of human placentas). Более того, в некоторых случаях вся плацента была образована потомками только одного из первых двух бластомеров, а ткани тела — потомками второго. И как минимум в одном случае (рис. 7) это помогло спасти организм от трисомии: судя по всему, один из бластомеров нес в себе лишнюю хромосому, но поскольку он «ушел» в плаценту, весь организм образовался из второго и вырос здоровым.

Рис. 7. Зарождение трисомии и спасение от нее. Слева направо: две материнские хромосомы не расходятся в мейозе, образуется зигота с тремя хромосомами. При ее дроблении возникают два бластомера, один из которых случайно теряет лишнюю хромосому. Его потомки остаются только в зародышевых тканях. Изображение из статьи T. Coorens et al., 2021. Inherent mosaicism and extensive mutation of human placentas

Исходя из этого, можно предположить, что плацента служит «отстойником» для сломавшихся бластомеров. Известно, по крайней мере, что в некоторых экспериментах сломавшиеся клетки вели себя по-разному в зависимости от расположения: в тканях зародыша они гибли апоптозом, а в тканях плаценты продолжали жить, хотя переставали делиться (H. Bolton et al., 2016. Mouse model of chromosome mosaicism reveals lineage-specific depletion of aneuploid cells and normal developmental potential). И можно представить себе, что состояние клеточного «здоровья» может стать критерием для выбора судьбы: те, кто негоден к службе в тканях организма, отправляются в тыл, где работают по мере сил.

Целое и его части

Судя по всему, развитие млекопитающих действительно регуляционное, и судьба бластомеров очень сильно зависит от случая. Именно поэтому их вклад часто оказывается неравномерным.

Первые бластомеры могут различаться по множеству параметров. Один может оказаться «сломан» или нести аномальный набор хромосом, в нем может хуже работать система репарации (а значит, число мутаций будет расти во всех его потомках) или он может быть менее «крепким» — содержать меньше белков или больше молекул-индукторов апоптоза. И в этих случаях, под действием клеточной конкуренции, которая здесь работает на благо развития зародыша, более слабому бластомеру приходится уйти — или «в ссылку» (во внезародышевые ткани), или насовсем (умереть). Это приводит к тому, что построением непосредственного тела организма начинает заниматься его собрат — а те мутации, которые возникли в его ДНК (а какие-то возникают неизбежно, еще с самого начала дробления, см. T. Bae et al., 2018. Different mutational rates and mechanisms in human cells at pregastrulation and neurogenesis), закрепляются во всех клетках тела. Так зародыш может на ранних этапах справиться с собственным мозаицизмом — правда, ценой закрепления точечных мутаций.

Но на первых делениях в эмбриогенезе эти процессы не заканчиваются. Конкуренция, «выдавливание» соседей и избирательное размножение продолжаются, когда начинают формироваться отдельные ткани и органы — и в них накапливаются свои мутанты (что, например, в мозге бывает связано с развитием неврологических и психиатрических болезней, см. A. Jourdon et al., 2020. The role of somatic mosaicism in brain disease).

И чем больше мы об этом знаем, тем сложнее становится судить о целом по его части. Коль скоро мутации накапливаются, например, в плаценте, несложно представить себе историю, в которой амниоцентез — биопсия внезародышевых тканей — говорит генетикам о том, что эмбрион безнадежно болен, в то время как на самом деле он здоров. Если наши органы могут происходить из разных бластомеров, а следовательно, накапливать в себе разные мутации, то можем ли мы по образцу крови или слюны судить о генах и предрасположенностях человека к болезням печени или почек?

Мозаицизм на поверку оказывается не случайным распределением клеток по тканям, а сложным феноменом, который эмбрион регулирует не вполне понятным для нас образом. Зародыш может пытаться избавиться от мозаицизма, с одной стороны, и гипертрофировать его (так что целый орган окажется генетически непохож на остальные) — с другой. И это всерьез осложняет наши манипуляции с зародышами на ранних стадиях развития. Если мы создали химеру из нескольких типов клеток, как сделать так, чтобы они сформировали органы равномерно — или наоборот, поделили их между собой (например, чтобы в целой свинье человеческими были только мышцы)? Если нам удалось отредактировать только один бластомер из двух — как сделать так, чтобы он пересилил соседа и пробился в собственные ткани зародыша?

Не так давно сразу три группы исследователей фактически освоили новый метод клонирования — создали полноценный эмбрион человека из дифференцированной клетки (X. Liu et al., 2021. Modelling human blastocysts by reprogramming fibroblasts into iBlastoids, L. Yu et al., 2021. Blastocyst-like structures generated from human pluripotent stem cells, B. Sozen et al., 2021. Reconstructing human early embryogenesis in vitro with pluripotent stem cells). При этом из клетки выращивают сначала культуру, похожую на плюрипотентные клетки, и уже из нее собирают аналог бластоцисты (рис. 8).

Рис. 8. Новый метод клонирования: взрослые фибробласты репрограммируют в эмбриональные клетки, а затем культивируют так, чтобы часть из них случайно дифференцировалась в предшественники зародышевых тканей, а часть — в предшественники внезародышевых. Затем в трехмерной культуре они собираются в аналог бластоцисты. Изображение из статьи X. Liu et al., 2021. Modelling human blastocysts by reprogramming fibroblasts into iBlastoids

Как поведет себя зародыш, в развитии которого не оказалось стадии дробления и конкуренции между бластомерами? Много ли потеряет эмбрион, который ворвался в жизнь не с самого ее начала? Новые исследования показывают, что чем тщательнее мы всматриваемся в раннее развитие человека, тем больше к нему пока возникает вопросов.

 

Полина Лосева

---