Появление коронавируса тяжелого острого респираторного синдрома (торс-ков) и ближневосточного респираторного синдрома (БВРС)-КоВ подчеркивает угрозу межвидовых событий передачи, приводящих к вспышкам среди людей. Здесь мы изучаем потенциал заболевания вирусом, подобным SARS, SHC014-CoV, который в настоящее время циркулирует в популяциях китайских подковообразных летучих ^{мышей 1} . Использование системы обратной генетики SARS-CoV ², мы сгенерировали и охарактеризовали химерный вирус, экспрессирующий Спайк коронавируса летучих мышей SHC014 в адаптированном к мышам позвоночнике SARS-CoV. Результаты показывают, что вирусы группы 2b, кодирующие Спайк SHC014 в костяке дикого типа, могут эффективно использовать несколько ортологов рецептора ангиотензинпревращающего фермента II (ACE2) человека, эффективно реплицироваться в первичных клетках дыхательных путей человека и достигать титров in vitro, эквивалентных эпидемическим штаммам SARS-CoV. Кроме того, in vivo эксперименты демонстрируют репликацию химерного вируса в легких мыши с заметным патогенезом. Оценка имеющихся иммунотерапевтических и профилактических методов на основе атипичной пневмонии выявила низкую эффективность; как моноклональные антитела, так и вакцинные подходы не смогли нейтрализовать и защитить от инфекции ков с использованием нового спайкового белка. На основании этих результатов мы синтетически воссоздали инфекционный полноразмерный рекомбинантный вирус SHC014 и продемонстрировали надежную вирусную репликацию как in vitro, так и in vivo. Наша работа предполагает потенциальный риск повторного возникновения торс-ков от вирусов, циркулирующих в настоящее время в популяциях рукокрылых.

Главная

Появление торс-ков ознаменовало новую эру в межвидовой передаче тяжелых респираторных заболеваний с глобализацией, ведущей к быстрому распространению по всему миру и массовым экономическим последствиям ^3 , 4 . С тех пор несколько штаммов, включая штаммы гриппа А H5N1, H1N1 и H7N9 и БВРС—КоВ, появились в популяциях животных, вызывая значительные заболевания, смертность и экономические трудности для пострадавших регионов ⁵ . Хотя меры общественного здравоохранения смогли остановить вспышку торс-ков ⁴ недавние метагеномные исследования выявили последовательности тесно связанных с SARS-подобных вирусов, циркулирующих в популяциях китайских рукокрылых, которые могут представлять собой будущую угрозу ^1, 6 . Тем не менее, только данные о последовательности обеспечивают минимальную информацию для идентификации и подготовки к будущим препандемическим вирусам. Поэтому, чтобы изучить потенциал возникновения (то есть потенциал заражения человека) циркулирующих ков летучих мышей, мы построили химерный вирус, кодирующий новый, зоонозный ков спайковый белок-из последовательности RsSHC014-ков, которая была выделена из китайских подковообразных летучих ^{мышей 1}—в контексте атипичной пневмонии-адаптированный костяк мыши. Гибридный вирус позволил нам оценить способность нового спайкового белка вызывать заболевание независимо от других необходимых адаптивных мутаций в его естественном костяке. Используя этот подход, мы охарактеризовали инфекцию ков, опосредованную спайковым белком SHC014 в первичных клетках дыхательных путей человека и in vivo, и проверили эффективность доступных иммунотерапевтических средств против SHC014-CoV. Вместе, стратегия переводит данные метагеномики, чтобы помочь предсказать и подготовиться к будущим возникающим вирусам.

Последовательности SHC014 и родственного RsWIV1-CoV показывают, что эти CoV являются наиболее близкими родственниками эпидемическим штаммам SARS-CoV ( рис. Однако существуют важные различия в 14 остатках, которые связывают человеческий ACE2, рецептор для SARS-CoV, включая пять, которые имеют решающее значение для диапазона хоста: Y442, L472, N479, T487 и Y491 (см. 7). В WIV1 три из этих остатков отличаются от эпидемического штамма SARS-CoV Urbani, но они, как ожидается, не изменят привязку к ACE2 ( дополнительный Рис.2). 1a, b и дополнительная таблица 1). Этот факт подтверждается обоими экспериментами по псевдотипированию, которые измеряли способность лентивирусов, кодирующих спайковые белки WIV1, проникать в клетки, экспрессирующие человеческий АСЕ2 (дополнительный Рис.2). 1) и анализами репликации in vitro WIV1-CoV (ref. 1). В отличие от этого, 7 из 14 остатков ACE2-взаимодействия в SHC014 отличаются от таковых в SARS-CoV, включая все пять остатков, критичных для диапазона хоста ( дополнительный фиг. 1С и дополнительная таблица 1 ). Эти изменения вкупе с отказом псевдотипированных лентивирусов, экспрессирующих Спайк SHC014, проникать в клетки (дополнительный фиг. 1d), предположил, что шип SHC014 не может связать человека ACE2. Однако сообщалось , что аналогичные изменения в родственных штаммах торс-ков позволяют связывать ^{АСЕ2 с 7 , 8}, что предполагает необходимость проведения дополнительного функционального тестирования для верификации. Поэтому мы синтезировали Спайк SHC014 в контексте компетентного для репликации, адаптированного к мышам остова SARS-CoV (далее мы будем называть химерный CoV SHC014-MA15), чтобы максимизировать возможность для изучения патогенеза и вакцинации у мышей ( дополнительный Рис.2). 2а). Несмотря на предсказания, полученные как в экспериментах по структурному моделированию, так и в экспериментах по псевдотипированию, SHC014-MA15 был жизнеспособным и реплицировался до высоких титров в клетках Vero ( дополнительный Рис.2). 2b). Подобно SARS, SHC014-MA15 также требовал функциональной молекулы ACE2 для входа и мог использовать ортологи человека, цибета и летучей мыши ACE2 ( дополнительный рис. 2c, d). Чтобы проверить способность шипа SHC014 опосредовать инфекцию дыхательных путей человека, мы исследовали чувствительность эпителиальной линии клеток дыхательных путей человека Calu-3 2B4 (ref. 9) к инфекции и обнаружена устойчивая репликация SHC014-MA15, сравнимая с таковой у больных ОРВИ ( Рис.2). 1С ). Чтобы расширить эти данные, первичные культуры эпителия дыхательных путей человека ( HAE) были инфицированы и показали надежную репликацию обоих вирусов (Рис.2). 1d). Вместе эти данные подтверждают способность вирусов с шипом SHC014 заражать клетки дыхательных путей человека и подчеркивают потенциальную угрозу межвидовой передачи вируса SHC014-CoV.

Рисунок 1: атипичные вирусы размножаются в клетках дыхательных путей человека и продуцируют патогенез in vivo.

а) полнометражные последовательности генома репрезентативных ков были выровнены и филогенетически картированы, как описано в онлайновых методах . Шкала представляет собой нуклеотидные замены, причем только поддержка bootstrap выше 70% маркируется. В дереве представлены ков, разделенные на три различные филогенетические группы, определяемые как α-ков, β-ков и γ-ков. Классические кластеры подгрупп обозначены как 2a, 2b, 2c и 2d для β-CoVs и как 1a и 1b для α-CoVs. (b) Аминокислотные последовательности доменов S1 спайков репрезентативных β-ков группы 2b, включая SARS-ков, были выровнены и филогенетически картированы. Шкала представляет собой аминокислотные замены. (c, d ) вирусная репликация SARS-CoV Urbani (черный) и SHC014-MA15 (зеленый) после инфицирования клеток Calu-3 2B4 ( c ) или хорошо дифференцированных, первичных воздушно-жидких межклеточных культур HAE ( d ) при кратности инфицирования (MOI) 0,01 для обоих типов клеток. Образцы были собраны в отдельные моменты времени с биологическими копиями (n = 3) для обоих экспериментов Calu-3 и HAE. (e, f) Потеря веса (н = 9 на торс-ков МА15; н = 16 для SHC014-МА15) (е) и репликацию вируса в легких (П = 3 торс-ков МА15; Н = 4 для SHC014-МА15) (Ф) от 10-недельных мышей линии balb/с, зараженных 1 × 10⁴ стр. Ф.у. мыши-приспособились торс-ков МА15 (черный) или SHC014-МА15 (зеленый) через интраназально (я.Н.) маршрут. показаны репрезентативные изображения срезов легких, окрашенных на антиген SARS-CoV N, от мышей, инфицированных SARS-CoV MA15 ( n = 3 мыши) (g ) или SHC014-MA15 ( n = 4 мыши) (h). Для каждого графика центральное значение представляет собой среднее значение по группе, А полосы ошибок определяют линейки масштаба s.e.m., 1 мм.

Полноразмерное изображение

Чтобы оценить роль шипа SHC014 в опосредовании инфекции in vivo, мы инфицировали 10-недельных мышей BALB / c 10 ⁴ бляшкообразующими единицами (p.f.u.) либо SARS-MA15, либо SHC014-MA15 ( Рис.2). 1e-h). Животные зараженные с SARS-MA15 испытали быструю потерю веса и летальность инфекцией столба 4 d (d.p.i.); в отличие от, инфекция SHC014-MA15 произвела существенную потерю веса (10%) но никакую летальность в мышах ( Fig. 1е). Исследование вирусной репликации выявило почти эквивалентные вирусные титры из легких мышей, инфицированных SARS-MA15 или SHC014-MA15 ( Рис.2). 1f). В то время как в легких от инфицированных SARS-MA15 мышей наблюдалось стойкое окрашивание как в терминальных бронхиолах, так и в паренхиме легких 2 Д.П.и. ( рис.1). 1g), те из shc014–MA15-зараженных мышей показали уменьшенное антигенное окрашивание дыхательных путей ( Fig. 1Н ); напротив, отсутствие дефицита антигенного окрашивания не наблюдалось ни в паренхиме, ни в общей гистологической картине, что свидетельствует о дифференциальной инфекции легочной ткани по SHC014-MA15 ( табл.2). Затем мы проанализировали инфекцию у более восприимчивых, возрастных (12-месячных) животных. SARS-MA15-инфицированные животные быстро худели и поддавались инфекции (Дополнительный Рис. 3а, б). Инфекция SHC014-MA15 вызвала прочную и устойчивую потерю веса, но имела минимальную летальность. Тенденции в гистологическом строении и характере окрашивания антигенов, которые мы наблюдали у молодых мышей, сохранялись и у более старых животных ( дополнительная таблица 3 ). Мы исключили возможность того, что SHC014-MA15 опосредовал инфекцию через альтернативный рецептор на основе экспериментов с использованием Ace2 ^−/− мышей, которые не показали потери веса или окрашивания антигена после инфекции SHC014-MA15 ( дополнительный Рис.2). 4a, b и дополнительная таблица 2). В совокупности полученные данные свидетельствуют о том, что вирусы с шипом SHC014 способны индуцировать потерю веса у мышей в условиях вирулентного ков костяка.

Учитывая доклиническую эффективность моноклональных антител к Эболе, таких как ZMApp ¹⁰ , мы далее попытались определить эффективность моноклональных антител к ОРВИ-ков против инфекции SHC014-MA15. Ранее сообщалось о четырех широко нейтрализующих человеческих моноклональных антителах, нацеленных на спайковый белок SARS-CoV, которые являются вероятными реагентами для иммунотерапии ^11, 12, 13. Мы исследовали влияние этих антител на вирусную репликацию (выраженное в процентном ингибировании вирусной репликации) и обнаружили, что при относительно низких концентрациях антител к ОРВИ дикого типа все четыре антитела были сильно нейтрализованы ( Рис.2). 2a-d ), нейтрализация варьировалась для SHC014-MA15. Fm6, антитело, генерируемое фагом display и escape мутантами ^11, 12, достигало только фоновых уровней ингибирования репликации SHC014-MA15 ( Рис.2). 2а). Аналогично, антитела 230.15 и 227.14, которые были получены из В-клеток памяти больных, инфицированных SARS-CoV ¹³, также не удалось заблокировать репликацию SHC014-MA15 ( рис. 2b, c). Для всех трех антител различия между спайковыми аминокислотными последовательностями SARS и SHC014 соответствовали прямым или смежным изменениям остатка, обнаруженным у мутантов побега SARS-CoV (fm6 N479R; 230.15 L443V; 227.14 K390Q/E), что, вероятно, объясняет отсутствие нейтрализующей активности антител против SHC014. Наконец, моноклональное антитело 109.8 смогло достичь 50% нейтрализации SHC014-MA15, но только при высоких концентрациях (10 мкг/мл) ( Рис.2). 2d). В совокупности полученные результаты демонстрируют, что широко нейтрализующие антитела против SARS-CoV могут иметь только предельную эффективность против эмерджентных SARS-подобных штаммов CoV, таких как SHC014.

Рисунок 2: моноклональные антитела к SARS-CoV имеют предельную эффективность в отношении SARS-подобных ков.

А – d) анализы нейтрализации, оценивающие эффективность (измеряемую как уменьшение количества бляшек) панели моноклональных антител, все из которых первоначально были получены против эпидемического ОРВИ-ков, против инфицирования клеток Vero атипичными антителами SARS-ков Urbani (черный) или SHC014-MA15 (зеленый). Антитела были протестированы fm6 (П = 3 для Урбани; П = 5 для SHC014-МА15)^11,12 (а), 230.15 (н = 3 для Урбани; н = 2 для SHC014-МА15) (б), 227.15 (н = 3 для Урбани; П = 5 для SHC014-МА15) (С) и 109.8 (П = 3 для Урбани; н = 2 для SHC014-МА15)¹³ (Д). Каждая точка данных представляет собой среднее значение группы и полосы ошибок определяют s. e. m.обратите внимание , что полосы ошибок в SARS-CoV Urbani–инфицированных клетках Vero в b, c перекрываются символами и не видны.

Чтобы оценить эффективность существующих вакцин против инфекции SHC014-MA15, мы вакцинировали пожилых мышей с двойным инактивированным целым SARS-CoV (DIV). Предыдущие работы показали, что DIV может нейтрализовать и защитить молодых мышей от вызова с гомологичным вирусом ¹⁴ ; однако вакцина не смогла защитить пожилых животных, у которых также наблюдалась повышенная иммунная патология, что указывает на возможность причинения вреда животным из-за вакцинации ¹⁵ . Здесь мы обнаружили, что DIV не обеспечивает защиту от проблемы с SHC014-MA15 в отношении потери веса или вирусного титра (Дополнительный Рис. 5а, б). В соответствии с предыдущим сообщением с другой гетерологичной группой 2b CoVs ¹⁵, сыворотка от DIV-вакцинированных пожилых мышей также не смогла нейтрализовать SHC014-MA15 (дополнительный рис. 5c). В частности, вакцинация DIV привела к устойчивой иммунной патологии ( дополнительная таблица 4 ) и эозинофилии (дополнительный Рис.2). 5d-f). В совокупности эти результаты подтверждают, что вакцина DIV не будет защищать от инфекции SHC014 и, возможно, может усилить заболевание в пожилой вакцинированной группе.

В отличие от вакцинации мышей с DIV, использование SHC014-MA15 в качестве живой, аттенуированной вакцины показало потенциальную перекрестную защиту от вызова с SARS-CoV, но результаты имеют важные предостережения. Мы заражали молодых мышей 10 ⁴ р. f. u. SHC014-MA15 и наблюдали их в течение 28 дней. затем мы вызывали мышей с SARS-MA15 на 29-й день ( дополнительный рис. 6а). Предыдущее заражение мышей высокой дозой SHC014-MA15 обеспечивало защиту от вызова со смертельной дозой SARS-MA15, хотя был только минимальный ответ на нейтрализацию SARS-CoV от антисыворотки, вызванной через 28 дней после заражения SHC014-MA15 ( дополнительный фиг. 6b, 1: 200). В отсутствие вторичного усиления антигена 28 d. p. i. представляет собой ожидаемый пик титров антител и подразумевает, что со временем будет уменьшена защита от ОРВИ ^16, 17. Аналогичные результаты, свидетельствующие о защите от challenge с летальной дозой SARS-CoV, наблюдались у пожилых мышей BALB/c в отношении снижения веса и репликации вируса (дополнительный Рис.2). 6c, d). Тем не менее, инфекционная доза SHC014-MA15 10 ⁴ p.f.u. индуцировала >10% потерю веса и летальность у некоторых пожилых животных (> Fig. 1 и дополнительные фиг. 3). Мы обнаружили, что вакцинация с более низкой дозой SHC014-MA15 (100 p.f. u.), не вызывала потерю веса, но также не смогла защитить пожилых животных от летальной дозы SARS-MA15 ( дополнительный Рис. 2). 6e, f). В совокупности полученные данные позволяют предположить, что SHC014-MA15 challenge может обеспечивать перекрестную защиту от ОРВИ-ков с помощью сохраненных эпитопов, но необходимая доза индуцирует патогенез и исключает использование в качестве аттенуированной вакцины.

Установив, что Спайк SHC014 обладает способностью опосредовать инфицирование клеток человека и вызывать заболевание у мышей, мы далее синтезировали полноразмерный инфекционный клон SHC014-CoV на основе подхода, используемого для SARS-CoV ( Рис.2). 3а) ² . Репликация в клетках Vero не выявила дефицита SHC014-CoV по сравнению с таковым для SARS-CoV ( рис. 3б); однако SHC014-CoV был достоверно ( Р < 0,01) аттенуирован в первичных культурах HAE как через 24, так и через 48 ч после заражения (рис.3в). 3c). In vivo заражение мышей не продемонстрировало достоверного снижения массы тела, но продемонстрировало снижение вирусной репликации в легких при полнокровной инфекции SHC014-CoV, по сравнению с ОРВИ ( Рис.2). 3d, e). В совокупности полученные результаты подтверждают жизнеспособность полноразмерного SHC014-CoV, но предполагают, что для его репликации требуется дальнейшая адаптация, эквивалентная репликации эпидемического SARS-CoV в респираторных клетках человека и мышей.

Рисунок 3: полнометражный SHC014-CoV реплицируется в дыхательных путях человека, но не обладает вирулентностью эпидемии SARS-CoV.

(а) схема SHC014-ков молекулярный клон, который был синтезирован в виде шести смежных кднк (места SHC014A, SHC014B, SHC014C, SHC014D, SHC014E и SHC014F) в окружении уникальных BglI сайтов, допускается для направленного собрания полной длины кднк выражая открытые рамки считывания (для 1а, 1б, Спайк, 3, габарит, матрица, 6-8 и нуклеокапсида). Подчеркнутые нуклеотиды представляют собой свисающие последовательности, образующиеся после расщепления фермента рестрикции. (b , c ) вирусная репликация SARS-CoV Urbani (black) или SHC014-CoV (green) после инфицирования клеток Vero ( b) или хорошо дифференцированные, первичные воздушно-жидкостные интерфейсные культуры клеток HAE (c) при MOI 0,01. Пробы отбирали в отдельные временные точки с биологическими копиями (n = 3) для каждой группы. Данные представляют собой один эксперимент для клеток Vero и HAE. (Д,Е) потеря веса (н = 3 торс-ков МА15, н = 7 для SHC014-ков; Н = 6 для ОРВИ-Урбани) (д) и репликацию вируса в легких (П = 3 торс-Урбани и SHC014-CoV) или (Е) от 10-недельных мышей линии balb/с, зараженных 1 × 10⁵ p. f. u. SARS-CoV MA15 (серый), SHC014-CoV (зеленый) или SARS-CoV Urbani (черный) по i.N. маршруту. Каждая точка данных представляет собой среднее значение по группе, А полосы ошибок определяют s.e.m. ** P < 0,01 и *** P < 0,001 с использованием T-критерия Стьюдента с двумя хвостами для отдельных временных точек.

Во время эпидемии торс-ков были быстро установлены связи между пальмовыми цибетами и штаммами ков, которые были обнаружены у людей ⁴ . Основываясь на этом выводе, общая парадигма эмерджентности утверждает, что эпидемия SARS-CoV возникла как вирус летучих мышей, перескочила на civets и включила изменения в рецептор-связывающем домене (RBD) для улучшения связывания с civet Ace2 (ref. 18). Последующее воздействие на людей на рынках живых животных позволило человеку заразиться штаммом циветты, который, в свою очередь, адаптировался, чтобы стать эпидемическим штаммом ( Рис.2). 4a). Однако филогенетический анализ позволяет предположить, что ранние штаммы атипичной пневмонии человека, по-видимому, более тесно связаны со штаммами летучих мышей, чем со штаммами циветты ¹⁸ . Таким образом, вторая парадигма утверждает, что прямая передача летучих мышей человеку инициировала возникновение атипичной пневмонии и что пальмовые циветты служили вторичным хозяином и резервуаром для продолжения инфекции ( Рис.2). 4b) ¹⁹. Для обеих парадигм спайковая адаптация во вторичном хозяине рассматривается как необходимость, причем большинство мутаций, как ожидается, произойдут в рамках RBD, тем самым способствуя улучшению инфекции. Обе теории подразумевают, что пулы Ковов летучих мышей ограничены и что мутации в диапазоне хозяина являются как случайными, так и редкими, уменьшая вероятность будущих событий возникновения у людей.

Рисунок 4: парадигмы возникновения коронавирусов.

Штаммы коронавируса сохраняются в квазивидовых пулах, циркулирующих в популяциях летучих мышей. (a , b ) традиционные теории возникновения торс-ков предполагают, что мутанты диапазона хозяина (красный круг) представляют собой случайные и редкие случаи, которые позволяют заражать альтернативных хозяев. Парадигма вторичного хозяина (а ) утверждает, что нечеловеческий хозяин заражен вирусом-прародителем летучих мышей и через адаптацию облегчает передачу людям; последующая репликация у людей приводит к эпидемическому вирусному штамму. Прямая парадигма ( b) предполагает, что передача происходит между летучими мышами и людьми без требования промежуточного хозяина; отбор затем происходит в человеческой популяции с тесно связанными вирусами, реплицирующимися во вторичном хозяине, что позволяет продолжать вирусную персистенцию и адаптацию в обоих случаях. (c) Данные по химерным вирусам, подобным SARS, утверждают, что квазивид-пул поддерживает несколько вирусов, способных заражать человеческие клетки без необходимости мутаций (красные круги). Хотя адаптация во вторичных или человеческих хозяевах может потребоваться для возникновения эпидемии, если вирусы, содержащие шипы SHC014, рекомбинируются с вирулентными костями ков (круги с зелеными контурами), то эпидемическое заболевание может быть результатом у людей. Существующие данные поддерживают элементы всех трех парадигм.

Хотя наше исследование не делает недействительными другие пути возникновения, оно утверждает третью парадигму, в которой циркулирующие пулы ковов летучих мышей поддерживают "уравновешенные" спайковые белки, которые способны заражать людей без мутации или адаптации ( Рис.2). 4c). Эта гипотеза иллюстрируется способностью химерного вируса, содержащего Спайк SHC014 в позвоночнике SARS-CoV, вызывать устойчивую инфекцию как в культурах дыхательных путей человека, так и у мышей без адаптации к РБД. Вкупе с наблюдением ранее выявленных патогенных ков позвоночника ^3, 20, наши результаты показывают, что исходные материалы, необходимые для возникновения SARS-подобных штаммов, в настоящее время циркулируют в резервуарах для животных. Примечательно, что хотя полноразмерный SHC014-CoV, вероятно, требует дополнительной базовой адаптации для опосредования заболевания человека, документированные высокочастотные рекомбинационные события в семьях CoV подчеркивают возможность будущего возникновения и необходимость дальнейшей подготовки.

На сегодняшний день геномные экраны популяций животных в основном используются для идентификации новых вирусов в условиях вспышки ²¹ . Предлагаемый здесь подход расширяет эти наборы данных для изучения вопросов возникновения вирусов и терапевтической эффективности. Мы рассматриваем вирусы со Спайком SHC014 как потенциальную угрозу из-за их способности к репликации в первичных культурах дыхательных путей человека, лучшей доступной модели для заболевания человека. Кроме того, наблюдаемый патогенез у мышей указывает на способность SHC014-содержащих вирусов вызывать заболевания в моделях млекопитающих без адаптации к РБД. В частности, дифференциальный тропизм в легких по сравнению с таковым при атипичной пневмонии и ослабление полноразмерного SHC014-CoV в культурах HAE по отношению к атипичной пневмонии предполагают, что факторы, выходящие за пределы связывания ACE2-включая Спайк-способность, био-доступность рецепторов или антагонизм иммунных реакций хозяина—могут способствовать возникновению эмерджентности. Тем не менее, необходимы дальнейшие испытания на нечеловеческих приматах, чтобы перевести эти находки в патогенный потенциал у людей. Важно отметить, что отсутствие доступных методов терапии определяет критическую необходимость дальнейшего изучения и разработки методов лечения. С помощью этих знаний можно создавать программы наблюдения, диагностические реагенты и эффективные методы лечения, которые являются защитными от возникновения специфичных для группы 2b ков, таких как SHC014, и они могут применяться к другим ветвям ков, которые поддерживают аналогичные гетерогенные пулы.

Помимо предложения подготовки к борьбе с будущими возникающими вирусами, этот подход должен рассматриваться в контексте санкционированной правительством США паузы в исследованиях усиления функции (GOF) ²² . На основе предыдущих моделей возникновения (рис. 4a, b), создание химерных вирусов, таких как SHC014-MA15, как ожидается, не приведет к повышению патогенности. Хотя SHC014-MA15 ослаблен относительно своего родительского мыш-приспособленного SARS-CoV, подобные исследования изучая патогенность CoV с диким типом Urbani Спайком внутри костяк MA15 не показали никакую потерю веса в мышах и уменьшили вирусную репликацию ²³. Таким образом, по отношению к Urbani spike–MA15 CoV, SHC014-MA15 показывает усиление патогенеза ( Рис.2). 1). На основании этих выводов группы научных обзоров могут счесть проведение аналогичных исследований по созданию химерных вирусов на основе циркулирующих штаммов слишком рискованным, поскольку нельзя исключать повышенную патогенность в моделях млекопитающих. В сочетании с ограничениями на мышиные адаптированные штаммы и разработку моноклональных антител с использованием escape-мутантов, исследования по возникновению ков и терапевтической эффективности могут быть серьезно ограничены. Вместе эти данные и ограничения представляют собой перекресток исследовательских проблем GOF; потенциал подготовки и смягчения последствий будущих вспышек должен быть сопоставлен с риском возникновения более опасных патогенов. При разработке дальнейшей политики важно учитывать ценность данных, полученных в результате этих исследований, а также необходимость дальнейшего изучения этих типов химерных вирусных исследований в сопоставлении с присущими им рисками.

В целом, наш подход использовал данные метагеномики для выявления потенциальной угрозы, создаваемой циркулирующей летучей мышью SARS-подобной CoV SHC014. Из-за способности химерных вирусов SHC014 реплицироваться в культурах дыхательных путей человека, вызывать патогенез in vivo и избегать текущей терапии, существует необходимость как в эпиднадзоре, так и в улучшенной терапии против циркулирующих SARS-подобных вирусов. Наш подход также открывает возможности использования данных метагеномики для прогнозирования возникновения вирусов и применения этих знаний при подготовке к лечению будущих возникающих вирусных инфекций.

Методы

Вирусы, клетки, in vitro инфекция и анализы зубного налета.

Дикого типа SARS-CoV (Urbani), адаптированного к мышам SARS-CoV (MA15) и химерного SARS-подобного CoV культивировали на клетках Vero E6 (полученных из Медицинского исследовательского института инфекционных заболеваний армии США), выращенных в модифицированной среде Орла Дульбекко (DMEM) (Gibco, CA) и 5% фетальной клоновой сыворотке (FCS) (Hyclone, South Logan, UT) наряду с антибиотиком/антимикотиком (Gibco, Carlsbad, CA). Клетки DBT (Baric laboratory, источник неизвестен), экспрессирующие ACE2, ранее были описаны как для человека, так и для циветты; последовательность Bat Ace2 была основана на том, что из Rhinolophus leschenaulti, и клетки DBT, экспрессирующие bat Ace2, были установлены, как описано ранее ⁸ . Эксперименты по псевдотипированию были аналогичны экспериментам с использованием псевдовируса на основе ВИЧ, приготовленного, как описано ранее ¹⁰ , и исследованного на клетках HeLa (Уханьский институт вирусологии), которые экспрессировали ACE2 orthologs. Клетки HeLa выращивали в минимальной эссенциальной среде (MEM) (Gibco, CA), дополненной 10% FCS (Gibco, CA), как описано ранее ²⁴ . Кривые роста в Vero E6, DBT, Calu-3 2B4 и первичных эпителиальных клетках дыхательных путей человека были выполнены в соответствии с ранее описанными ^8, 25. Ни один из рабочих запасов клеточной линии не был аутентифицирован или протестирован на наличие микоплазмы в последнее время, хотя исходные семенные запасы, используемые для создания рабочих запасов, свободны от загрязнения. Человеческие легкие для культур HAE были закуплены под Университетом Северной Каролины в Chapel Hill Institutional Review Board-approved protocols. Культуры HAE представляют собой высокодифференцированный эпителий дыхательных путей человека, содержащий реснитчатые и нецилированные эпителиальные клетки, а также бокаловидные клетки. Культуры также выращивают на воздушно-жидкостном интерфейсе в течение нескольких недель перед использованием, как описано ранее ²⁶. Вкратце клетки промывали PBS и инокулировали вирусом или макетом-разбавляли в PBS в течение 40 мин при 37 °C. После инокуляции клетки промывали трижды и добавляли свежую среду для обозначения времени '0'. Три или более биологических копии были собраны в каждый описанный момент времени. Ни в одной из выборочных коллекций ослепление не применялось, а выборки не были рандомизированы. Все культивирование вируса проводили в лаборатории уровня биобезопасности (BSL) 3 с резервными вентиляторами в шкафах биобезопасности, как описано ранее нашей группой ². Весь персонал был одет в мощные респираторы для очистки воздуха (Breath Easy, 3M) с костюмами Tyvek, фартуками и пинетками и был одет в двойные перчатки.

Кластеризация последовательностей и структурное моделирование.

Полнометражные геномные последовательности и аминокислотные последовательности доменов S1 Спайка репрезентативных CoV были загружены из Genbank или центра интеграции ресурсов Патосистем (PATRIC), выровнены с ClustalX и филогенетически сопоставлены с помощью оценки максимального правдоподобия с использованием 100 бутстрэпов или с помощью PhyML ( https://code.google.com/p/phyml/) пакет, соответственно. Дерево было сгенерировано с использованием максимального правдоподобия с помощью пакета PhyML. Шкала представляет собой нуклеотидные замены. Только узлы с поддержкой bootstrap выше 70% помечены. Дерево показывает, что ков делятся на три различные филогенетические группы, определенные как α-ков, β-ков и γ-ков. Классические кластеры подгрупп обозначены как 2a, 2b, 2c и 2d для β-CoVs, а также 1a и 1b для α-CoVs. Структурные модели были сгенерированы с помощью Modeller (Max Planck Institute Bioinformatics Toolkit) для создания гомологических моделей для SHC014 и Rs3367 RBD SARS в комплексе с ACE2 на основе кристаллической структуры 2AJF (Банк данных белков). Модели гомологии были визуализированы и обработаны в MacPyMol (версия 1.3).

Конструирование торс-подобных химерных вирусов.

Как дикие, так и химерные вирусы были получены либо из SARS-CoV Urbani, либо из соответствующего мышиного адаптированного (SARS-CoV MA15) инфекционного клона (ic) , как было описано ранее ²⁷. Плазмиды, содержащие спайковые последовательности для SHC014, были экстрагированы рестрикционным дайджестом и лигированы в плазмиду E и F инфекционного клона MA15. Клон был разработан и приобретен у компании Bio Basic в виде шести смежных cdna с использованием опубликованных последовательностей, фланкированных уникальными сайтами эндонуклеазы рестрикции II класса (BglI). После этого плазмиды, содержащие фрагменты генома дикого типа, химерные SARS-CoV и SHC014-CoV, амплифицировали, иссекали, лигировали и очищали. In vitro затем были проведены реакции транскрипции для синтеза полноразмерной геномной РНК, которая была трансфицирована в клетки Vero E6, как описано ранее ² . Среда из трансфецированных клеток собиралась и служила семенным материалом для последующих экспериментов. Химерные и полноразмерные вирусы были подтверждены последовательным анализом перед использованием в этих исследованиях. Синтетическая конструкция химерного мутанта и полноразмерного SHC014-CoV была одобрена Комитетом по институциональной биобезопасности Университета Северной Каролины и Комитетом по исследованиям двойного назначения концерна.

Этическое заявление.

Данное исследование проводилось в соответствии с рекомендациями по уходу и использованию животных Управления по охране лабораторных животных (OLAW), NIH. Институциональный Комитет по уходу и использованию животных (IACUC) Университета Северной Каролины в Чапел-Хилле (UNC, разрешение № A-3410-01) одобрил протокол исследования животных (IACUC #13-033), используемый в этих исследованиях.

Мыши и инфекция in vivo.

Самки, 10-недельные и 12-месячные мыши BALB/cAnNHsD были заказаны из лабораторий Harlan Laboratories. Инфекции мыши были сделаны как ранее описано ²⁰ . Вкратце, животные были доставлены в лабораторию BSL3 и позволили акклиматизироваться в течение 1 недели до заражения. Для заражения и вакцинации живыми аттенуированными вирусами мышей обезболивали смесью кетамина и ксилазина и заражали интраназально, при вызове, 50 мкл фосфатно-буферного физиологического раствора (ФБС) или разбавляли вирус тремя или четырьмя мышами в каждый момент времени, на каждую инфекционную группу в дозе, как описано на рисунке. Для отдельных мышей обозначения инфекции, включая невозможность вдыхать всю дозу, пузырчатый прививочный материал из носа или инфекцию через рот, возможно, привели к исключению данных мыши по усмотрению исследователя; постинфекция, никакие другие заранее установленные критерии исключения или включения не определены. Ни в одном эксперименте на животных не применялось ослепление, и животные не были рандомизированы. Для вакцинации молодых и старых мышей вакцинировали путем инъекции footpad с объемом 20 мкл либо 0,2 мкг двухинактивированной вакцины SARS-CoV с квасцами, либо макетом PBS; мыши были затем усилены с тем же режимом 22 d позже и бросил вызов 21 d после этого. Во всех группах, согласно протоколу, животные ежедневно наблюдались за клиническими признаками заболевания (сгорбленность, взъерошенность шерсти и снижение активности) на протяжении всего периода эксперимента. Потеря веса контролировалась ежедневно в течение первых 7 дней, после чего контроль веса продолжался до тех пор, пока животные не восстановили свой первоначальный исходный вес или не показали увеличение веса непрерывно в течение 3 дней. Все мыши, потерявшие более 20% от своей исходной массы тела, получали наземное кормление и дальнейшее наблюдение несколько раз в день, пока они находились под 20%-ным ограничением. Мыши, потерявшие более 30% от своей исходной массы тела, были немедленно принесены в жертву в соответствии с протоколом. Любая мышь, считающаяся умирающей или маловероятной для выздоровления, также была гуманно принесена в жертву по усмотрению исследователя. Эвтаназия была выполнена с использованием передозировки изофлурана, и смерть была подтверждена шейным вывихом. Все исследования на мышах были проведены в Университете Северной Каролины (Animal Welfare Assurance #A3410-01) с использованием протоколов, утвержденных Учрежденческим Комитетом ООН по уходу за животными и использованию (IACUC).

Гистологический анализ.

Левое легкое было удалено и погружено в 10% забуференный формалин (Фишер) без инфляции в течение 1 недели. Ткани были погружены в парафин и 5-мкм срезы были подготовлены в центре Гистопатологии комплексного онкологического центра UNC Lineberger core facility. Для определения степени окрашивания антигена срезы окрашивали на вирусный антиген с использованием коммерчески доступного поликлонального анти-Нуклеокапсидного антитела SARS-CoV (Imgenex) и забивали слепым способом путем окрашивания дыхательных путей и паренхимы, как описано ранее ²⁰. Изображения были сняты с помощью микроскопа Olympus BX41 с камерой Olympus DP71.

Анализы нейтрализации вирусов.

Определение титра нейтрализации снижения бляшки проводили с использованием ранее охарактеризованных антител против SARS-CoV, как описано ранее ^11, 12, 13 . Коротко говоря, нейтрализующие антитела или сыворотку последовательно разводили двукратно и инкубировали со 100 p.f. U. различных штаммов инфекционного клона SARS-CoV в течение 1 ч при 37 °C. Затем вирус и антитела добавляли в 6-луночную пластинку с 5 × 10 ⁵ клетками Vero E6 / well с множественными копиями ( n ≥ 2). После 1-часовой инкубации при 37 °С клетки накладывали на среду 3 мл 0,8% агарозы. Пластины инкубировали в течение 2 суток при 37 °с, окрашивали нейтральным красным цветом в течение 3 ч и подсчитывали количество бляшек. Процент уменьшения зубного налета был рассчитан как (1 − (нет. бляшек с антителами/нет. бляшек без антитела)) × 100.

Статистический анализ.

Все эксперименты были проведены с контрастированием двух экспериментальных групп (либо двух вирусов, либо вакцинированных и невакцинированных когорт). Таким образом, достоверные различия в титре вируса и оценке гистологической картины определялись с помощью двукратного t-критерия Стьюдента в отдельные моменты времени. Данные были нормально распределены в каждой сравниваемой группе и имели одинаковую дисперсию.

Биобезопасность и биозащищенность.

Отчетные исследования были начаты после того, как институциональный Комитет по биобезопасности Университета Северной Каролины утвердил экспериментальный протокол (название проекта: генерация инфекционных клонов летучих мышей SARS-подобных ков; план безопасности Лаборатории ID: 20145741; график G ID: 12279). Эти исследования были начаты еще до того, как правительство США приостановило финансирование исследований по отдельным функциональным исследованиям, связанным с вирусами гриппа, БВРС и торс ( http://www.phe.gov/s3/dualuse/Documents/gain-of-function.pdf). Этот документ был рассмотрен финансовым агентством, NIH. Было предложено продолжить эти исследования, и это было одобрено Национальным институтом здравоохранения.

SARS-CoV является избранным агентом. Все работы по этим исследованиям проводились в соответствии с утвержденными стандартными рабочими процедурами (Соп) и условиями безопасности для торс-ков, БВРС-КоВ и других связанных с ними ков. Наши институциональные объекты CoV BSL3 были разработаны в соответствии с требованиями безопасности, которые рекомендуются в области биобезопасности в микробиологических и биомедицинских лабораториях (BMBL), Министерстве здравоохранения и социальных служб США, службе общественного здравоохранения, центрах по контролю заболеваний (CDC) и NIH. Планы безопасности лабораторий были представлены, и объект был утвержден для использования Департаментом ООН по охране окружающей среды и безопасности (EHS) и CDC. Доступ к электронной карте необходим для входа в объект. Все работники были обучены EHS безопасно использовать приведенные в действие респираторы очищать воздуха (PAPRs), и соотвествующие привычки работы в средстве BSL3 и активных планах медицинского наблюдения на месте. Наши средства CoV BSL3 содержат резервные вентиляторы, аварийное питание к вентиляторам и биологическим шкафам и замораживателям безопасности, и наши средства могут приспособить шкафы мыши SealSafe. Материалы, классифицируемые как агенты BSL3, состоят из штаммов-предшественников SARS-CoV, bat-CoV, MERS-CoV и мутантов, полученных из этих патогенов. На установках BSL3 эксперименты с инфекционным вирусом проводятся в сертифицированном Биобезопасном шкафу класса II (BSC). Все сотрудники носят скрабы, костюмы Tyvek и фартуки, Папры и бахилы, а их руки одеты в двойные перчатки. Пользователи BSL3 подпадают под действие плана медицинского наблюдения, контролируемого клиникой профессионального здоровья сотрудников Университета (UEOHC), который включает ежегодную физическую, ежегодную вакцинацию против гриппа и обязательное представление информации о любых симптомах, связанных с инфекцией Ков, в периоды работы в BSL3. Все пользователи BSL3 проходят подготовку по управлению экспозицией и протоколам отчетности, подготовлены к самокарантину и прошли подготовку для безопасной доставки в местное отделение по борьбе с инфекционными заболеваниями в чрезвычайной ситуации. Все потенциальные события воздействия сообщаются и исследуются EHS и UEOHC, причем отчеты подаются как в ЦКЗ, так и в NIH.

Оригинал